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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Externe und interne Lösungen
- Verwenden Sie die Ringer-Lösung von Säugetieren während der Netzhautdissektion und als externe Lösung bei der anschließenden elektrophysiologischen Aufzeichnung. Bereiten Sie die Ringer-Lösung für Säugetiere aus 10-facher Stammlösung (ohne Kalzium) am Tag der Aufzeichnung vor und fügen Sie CaCl2 tropfenweise nach 15 min Carbogenation (95 % O2 und 5 % CO2) zu. Die endgültige 1x-Lösung enthält (in mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2 HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 und 10 D-Glukose.
- Verwenden Sie zwei interne Lösungen, um SAC-Oszillationen zu charakterisieren. Testen Sie die Nützlichkeit von vorbereiteten Lösungen bei längeren Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen an adulten retinalen Ganglienzellen (RGCs) der Maus und lagern Sie die verifizierten Chargen in 500 μl Aliquoten bei -20 °C bis zur Verwendung.
- Verwenden Sie zur Aufzeichnung der Membranpotentialoszillation eine interne Lösung auf Kaliumbasis, die (in mM) enthält: 125 K-Gluconat, 8 NaCl, 4 Adenosintriphosphat (ATP)-Mg, 0,5 Li-Guanosintriphosphat (GTP), 5 Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 10 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES) und 0,2 % Biocytin (w/v). Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,3 ein.
- Verwenden Sie zur Aufzeichnung exzitatorischer und inhibitorischer postsynaptischer Ströme eine interne Lösung auf Cäsiumbasis, die (in mM) enthält: 100 Cs-Methansulfonat, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES und 0,2 % Biocytin (w/v). Stellen Sie den pH-Wert mit CsOH auf 7,3 ein.
>2. Vorbereitung auf den Tag der Aufnahme
- Um eine Nitrozellulosemembran mit offenen Löchern vorzubereiten, stanzen Sie die Membran manuell mit einem speziell angefertigten Locher aus einer abgestumpften 16-G-Spritzennadel und glätten Sie die Membran zwischen zwei sauberen Glasplatten. Für eine Whole-Mount-Netzhaut machen Sie ein zentrales Loch mit einem Durchmesser von 0,2 mm und umgeben es mit 4 größeren Löchern mit einem Durchmesser von 1-1,2 mm.
- Um ein individuelles Verfüllfilament zum Laden der inneren Lösung in Elektroden herzustellen, schmelzen Sie eine 10-μl-Pipettenspitze in der Mitte und verlängern Sie den geschmolzenen Teil vorsichtig, bis er abkühlt und aushärtet. Verwenden Sie kurz vor der Verwendung eine saubere Rasierklinge, um das Filament zu kürzen, bis es etwas länger ist als die Patch-Pipetten.
- Ziehen Sie Patch-Pipetten in einem programmierbaren Abzieher aus einem Borosilikatglasrohr mit einem internen Filament. Stellen Sie die Mikropipetten am Tag des Experiments her und verwenden Sie sie sofort.
Anmerkung: Für die Aufnahme von SACs verwenden wir die folgende Abzieher-Einstellung: Hitze: 484; Zug: 0; Geschwindigkeit: 25; Verzögerungszeit: 1; Druck: 400 und ein Rampenwert von 462. Der Außendurchmesser (O.D.) und der Innendurchmesser (I.D.) der Borosilikatrohre betragen 1,65 mm bzw. 1,0 mm. Der Widerstand der Pipetten beträgt 10-14 MΩ.
- Tauen Sie eine Stunde vor der Gewebeentnahme ein Röhrchen mit der inneren Lösung auf, indem Sie es >30 Minuten lang auf einem Wirbel schütteln.
>3. Sektion der Netzhaut
- Betäuben Sie das Tier mit 4 % Isofluran in Sauerstoff, bis das Tier die Reaktionsfähigkeit auf ein Zehenklemmen verliert. Opfern Sie das Tier durch Zervixluxation.
- Schneiden Sie beide Augäpfel von den Sehnerven in 1-2 mm Entfernung von den Sehnervenköpfen mit einer geraden Irisschere ab.
- Rollen Sie die Augäpfel auf einem sauberen Papiertuch, um Blut zu entfernen, und tauchen Sie sie dann in karbogenierte Säugetier-Ringer-Lösung. Stanzen Sie mit einer 23 G Nadel ein Loch in den Limbus und halbieren Sie die Augäpfel, indem Sie mit einer Mikroschere entlang des Limbus schneiden. Entfernen Sie die Hornhaut und die Linse mit einer feinen Pinzette.
- Für die retinale Ganzmontage ziehen Sie die gesamte Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette vom pigmentierten Epithel ab und machen Sie vier 1,5-2 mm lange orthogonale Schnitte vom Rand in Richtung des Sehnervenkopfes.
- Tauchen Sie eine gestanzte Nitrozellulosemembran in die Schale und ziehen Sie die Netzhaut vorsichtig mit der Ganglienzellschicht (GCL) nach oben darüber. Platzieren Sie den Sehnervenkopf in das mittlere Loch, wenn Sie eine Whole-Mount-Netzhaut vorbereiten. Übertragen Sie die Membran mit der Netzhaut in eine andere saubere Schüssel. Glätten Sie die Netzhaut vorsichtig mit einem feinen Pinsel, sodass sie wie ein Malteserkreuz aussieht, und legen Sie alle vier Kanten über die Löcher.
- Wenn jeweils ein Bruchteil der Netzhaut untersucht werden soll, schneiden Sie jede Augenmuschel, die aus Schritt 3.3 hergestellt wurde, mit einer Rasierklinge in 3-4 Stücke, an denen das pigmentierte Epithel befestigt bleibt. Schützen Sie die unbenutzten Teile vor Licht in einer karbogenierten externen Lösung und verwenden Sie sie innerhalb von 12 Stunden.
- Tupfen Sie die Nitrozellulosemembran mit einem Stück trockenem Filterpapier ab und entfernen Sie die glasartige und innere Begrenzungsbahn mit einer Pinzette und einem Pinsel.
- Stellen Sie sicher, dass alle Netzhautränder vollständig mit der Membran verbunden sind, bevor Sie die Baugruppe mit einem versiegelten Glasabdeckglas an der Unterseite in die Aufnahmekammer übertragen. Befestigen Sie die Membran mit Vakuumfett auf dem Deckglas und rehydrieren Sie die Netzhaut mit der externen Lösung. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen unter der Baugruppe eingeschlossen werden.
- Stellen Sie die Kammer auf den Tisch eines aufrechten Mikroskops. Perfundieren Sie die Kammer mit warmer (34-35 °C) karbogenierter externer Lösung mit einer Geschwindigkeit von ~3 ml pro min.
- Untersuchen Sie zuerst die Netzhaut unter einer 10-fachen Objektivlinse und verwenden Sie dann eine 60-fache Wasserimmersionslinse, um GCL und Neuronen der inneren Kernschicht (INL) unter differentiellem Interferenzkontrast (DIC) und/oder Epifluoreszenz zu sehen. Um tdTomato-exprimierende SACs sichtbar zu machen, verwenden Sie eine weiße Leuchtdiode (LED) in Kombination mit einem Anregungsfilter von 554 nm und einem Emissionsfilter von 581 nm.
>4. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme von Flat-Mount-Retina
- Filtern Sie die innere Lösung durch einen Spritzenvorsatzfilter in das kundenspezifische Verfüllfilament.
- Führen Sie das Filament in eine frisch gezogene Mikropipette ein und geben Sie die innere Lösung in der Nähe der Spitze ab, bis die Lösung den silbernen Elektrodendraht für >5 mm bedeckt. Befestigen Sie die Mikropipette an einem Elektrodenhalter mit einer Saugstange, durch die der Druck im Inneren der Elektrode durch Drücken oder Ziehen des Kolbens einer sondenverbundenen 10-ml-Kunststoffspritze eingestellt werden kann.
- Suchen Sie die Pipette unter dem Objektiv und bringen Sie sie auf ~100 μm über der Netzhaut. Verwenden Sie im Stromfolgermodus (I = 0) den DC-Offset, um das stehende Gleichspannungssignal auf Null zu setzen. Messen Sie den Pipettenwiderstand im Stromzangenmodus (IClamp), indem Sie Rechteckströme mit fester Amplitude durch die Pipette injizieren, während sie sich im Bad befindet, und neutralisieren Sie die Differenz durch Drehen des Raccess-Knopfes. Verwenden Sie den Messwert auf dem Raccess-Knopf, um den Pipettenwiderstand nach dem Ohmschen Gesetz zu berechnen.
- Bringen Sie die Elektrode langsam auf ~10 μm über die Netzhaut. Üben Sie Überdruck auf die Elektrode aus. Beobachten Sie, wie sich die Reflexion in der Nähe der Pipettenspitze ändert, wenn sie sich der Netzhaut nähert. Drücken Sie die Pipette schnell aber vorsichtig in den GCL und reduzieren Sie sofort den Überdruck.
- Bewegen Sie die Pipette in Richtung eines markierten Neurons. Vermeiden Sie den Kontakt mit anderen Neuronen, Blutgefäßen und Endfüßen von Müller-Zellen. Üben Sie bei Bedarf mehr Überdruck aus, um ein Verstopfen der Elektrode zu verhindern.
- Positionieren Sie die Pipettenspitze in der Nähe der Mittellinie eines markierten Neurons, bis ein Grübchen sichtbar ist. Lassen Sie den Überdruck ab und lassen Sie die Plasmamembran auf die Pipettenspitze zurückprallen.
- Wenden Sie negative Ströme von 20 bis 120 pA an die Pipette an, um die Bildung einer Giga-Ohm-Dichtung zu unterstützen. Üben Sie bei Bedarf einen sanften Sog aus, um die Plasmamembran in die Pipette zu ziehen. Warten Sie 5 Minuten nach der Versiegelungsbildung, um die Zellmembran zu durchbrechen. Auf diese Weise kann die verschüttete innere Lösung durch Superfusion gereinigt werden. Reißen Sie die Membran durch einen sanften Sog auf.
- Nach dem Bruch der Membran und im aktuellen Klemmmodus die Brückenbalance einschalten und mit dem Raccess-Knopf einstellen.
Anmerkung: Für eine kleine Zelle wie die SAC ist nur eine geringfügige Anpassung erforderlich, wenn überhaupt. Alternativ können Sie erregende und inhibitorische postsynaptische Ströme im Spannungsklemmenmodus (V Clamp) aufzeichnen, indem Sie dieZelle auf Umkehrpotentiale von Chlorid (ca. -75 mV) bzw. Glutamat (ca. 0 mV) halten. Überprüfen und passen Sie die Pipettenposition bei Bedarf an, um gelegentliche Netzhaut- und/oder Mikromanipulatordrift auszugleichen.
- Zur Aufzeichnung des Membranpotentials oder der Stromänderung vor, während und nach der pharmakologischen Behandlung sind synaptische Blocker (z. B. Cyanquixalin [CNQX], (2R)-amino-5-phosphonopentanoat [AP5], Picrotoxin, Tubocurarin usw.) und Kanalmodulatoren (z. B. Flupirtin, Dopamin, Meclofenaminsäure usw.) am Tag des Versuchs frisch aus gefrorenen Beständen herzustellen. Verdünnen Sie die Arzneimittel mit karbogenierter Ringer-Lösung. Tragen Sie sie chargenweise durch Perfusion auf.
- Entfernen Sie nach der Aufnahme vorsichtig die Pipette aus dem Soma. Bringen Sie die Baugruppe aus der Kammer in eine saubere Schüssel. Lösen Sie die Netzhaut ab und befestigen Sie sie wieder auf einer anderen abgeflachten Nitrozellulosemembran ohne gestanzte Löcher, um eine Planheit der Netzhaut während der Fixierung zu gewährleisten.