Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Montieren von Rückenmarksgewebeschnitten auf MEAs
- Steriles Nährmedium im Inkubator erwärmen (37 °C, Deckel für Sauerstoffzufuhr leicht abgeschraubt).
- Positionieren Sie das Mehrelektrodenarray oder MEA mit einer sterilen Pinzette mit gummiummantelten Spitzen bei Raumtemperatur (RT) in der Petrischale unter einem Stereomikroskop, wobei das Elektrodenarray fokussiert ist. Zentrieren Sie ein 6-μl-Tröpfchen Hühnerplasma auf dem sauberen, staubfreien und sterilen Elektrodenarray. Schieben Sie mit einem kleinen Spatel vorsichtig zwei Rückenmarksabschnitte mit den Bauchseiten zueinander in das Plasmatröpfchen. Berühren Sie die Elektroden nicht mit dem Spatel.
- Geben Sie 8 μl Thrombin um das Hühnerplasma-Tröpfchen. Mit der Thrombin-Pipettenspitze die Mischung aus Hühnerplasma und Thrombin vorsichtig mischen und auf den beiden Scheiben verteilen. Auch hier gilt: Berühren Sie das spröde Elektrodenarray nicht direkt. Kurz vor der Gerinnung überschüssiges Hühnerplasma/Thrombin aspirieren.
- Verschließen Sie die Petrischale, um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu erhalten, während die MEA/Kulturbaugruppe etwa 1 Stunde lang in einer befeuchteten Kammer im Inkubator bei 37 °C verbleibt.
- Geben Sie vorsichtig 10 μl Nährmedium in die Kulturkammer, verschließen Sie die Petrischale und stellen Sie sie für ca. 30 Minuten wieder in den Inkubator.
- Legen Sie jede MEA/Kultureinheit mit sterilen, gummiummantelten Spitzen in ein Rollröhrchen, fügen Sie 3 ml Nährmedium hinzu und schließen Sie den Deckel fest. Legen Sie das Rollenrohr in die Walzentrommel und drehen Sie sich mit 1 - 2 U/min im Inkubator in einer 5% CO2 -haltigen Atmosphäre bei 37 °C.
- Wechseln Sie die Hälfte des Nährmediums nach 7 Tagen in vitro (DIV) und danach 1 - 2 Mal pro Woche.
>2. Mechanische Läsionen
- Nehmen Sie die MEA/Kultur-Baugruppe mit sterilen, gummiummantelten Spitzen aus dem Rollröhrchen und legen Sie sie in eine Petrischale ohne Nährmedium unter ein Stereomikroskop mit dem Gewebe im Fokus. Überprüfen Sie visuell, ob die beiden Slices verschmolzen sind.
- Halten Sie die MEA/Kultur-Baugruppe ruhig, indem Sie eine Pinzette mit gummiüberzogenen Spitzen auf den MEA legen.
- Platzieren Sie eine Skalpellklinge in der Rille des MEA in der Nähe der Gewebeschnitte. Halten Sie das Skalpell eher waagerecht.
- Heben Sie den Skalpellgriff an, lassen Sie die Skalpellklinge aber so in der Rille des MEA bleiben, dass die Klinge von der Basis bis zur Spitze "rollt" und dadurch das Gewebe durchtrennt, das die Rille bedeckt.
- Eventuelle Gewebeverbindungen mit einer 25 G Nadelspitze verschließen, falls erforderlich. Arbeiten Sie nur im Bereich innerhalb der Rille und berühren Sie nicht die zarten Kanten.
- Setzen Sie die MEA/Kulturbaugruppe wieder in das Rollenrohr ein. Geben Sie den Kulturen 3 ml frisches Nährmedium und geben Sie sie zurück in die Rolltrommel im Inkubator.
>3. Elektrophysiologische Aufzeichnungen spontaner Aktivität
- Um die funktionelle Regeneration zwischen den beiden Rückenmarksschnitten nach der gewählten Anzahl von DIV zu untersuchen, montieren Sie die MEA/Kultur-Einheit in einer Aufnahmekammer an einem Mikroskop und tragen Sie etwa 500 μl extrazelluläre Lösung auf (siehe Materialliste).
- Warten Sie 10 Minuten vor der ersten Aufnahme, damit sich das System stabilisieren kann.
- Zeichnen Sie die grundlegende spontane Aktivität 2x für ca. 10 Minuten von jeder aktivitätsdetektiven Elektrode des MEA bei RT auf.
- Um stabile, extrazelluläre Bedingungen zu gewährleisten, tauschen Sie die extrazelluläre Lösung nach jeder Aufnahmesitzung aus.
- Um das Netzwerk zu enthemmen, tragen Sie eine extrazelluläre Lösung auf, die Strychnin (1 μM) und Gabazin (10 μM) enthält. Warten Sie mindestens 2 Minuten, bevor Sie die Aufzeichnung starten.
>4. Datenanalyse
HINWEIS: Für die Detektion der extrazellulär aufgezeichneten Aktionspotentiale verwenden Sie einen Detektor, der auf Standardabweichungen basiert, und einen nachfolgenden Diskriminator für jede Elektrode.
- Zeigen Sie die detektierte neuronale Aktivität jeder Elektrode in einem Rasterdiagramm nach Standardverfahren an (Abbildung 1F).
- Ermitteln und zeigen Sie die gesamte Netzwerkaktivität für jeden Slice an, indem Sie die Anzahl der Ereignisse in den entsprechenden Kanälen innerhalb eines gleitenden Fensters von 10 ms zusammenfassen, das in Schritten von 1 ms verschoben wird (Abbildung 1G).
- Erkennen Sie in jeder Schicht einzelne Bursts (Aktivitätscluster, die auf mehreren Elektroden auftreten). Legen Sie daher einen minimalen Schwellenwert für die Spitzenaktivität in der entsprechenden Gesamtnetzwerkaktivität fest, und definieren Sie jeden Burst-Start und jedes Burst-Ende. Ein geeigneter Schwellenwert liegt z. B. bei 25 % der durchschnittlichen Burst-Amplitude, und ein Burst-Start kann als erstes Ereignis in einem Zeitfenster von mindestens 5 ms definiert werden, und ein Burst-Ende als letztes Ereignis in einem Zeitfenster von mindestens 25 ms.
- Um die funktionelle Regeneration zu quantifizieren, berechnen Sie den Prozentsatz der synchronisierten Bursts zwischen den beiden Slices. Berechnen Sie dazu die Latenz zwischen einem Burst in einem Slice und dem folgenden Burst im anderen Slice.
Anmerkung: Ein Burst-Paar wird als "synchronisiert" bezeichnet, wenn die Latenz kleiner als die durchschnittliche Burst-Länge ist. Gerade in Co-Kulturen mit viel Aktivität besteht die Möglichkeit, dass beide Seiten zufällig einen Burst im gewählten Latenzfenster initiieren. Diese Tatsache muss bei der Quantifizierung des Prozentsatzes der synchronisierten Bursts berücksichtigt werden.
