Externe Erregung von eindimensional gemusterten neuronalen Kulturen

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Quelle:Stern, S., et al. Externe Anregung von Neuronen mit elektrischen und magnetischen Feldern in ein- und zweidimensionalen Kulturen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Stimulation von liniengemusterten neuronalen Kulturen mit einem gleichmäßigen, unidirektionalen elektrischen Feld.

Protokoll

>1. Abbildung spontaner oder evozierter Aktivität in neuronalen Kulturen mit Fluoreszenzfarbstoffen.

Eine Lösung aus 50 μg calciumsensitivem Fluoreszenzfarbstoff (siehe Tabelle der Materialien/Reagenzien) in 50 μl DMSO (Dimethylsulfoxid) herstellen.
Bereiten Sie eine extrazelluläre Aufzeichnungslösung (EM) vor, die (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-Glukose, 45 Saccharose (pH 7,4) enthält.
Inkubieren Sie die neuronale Kultur in 2 mL EM mit 8 μl der calciumsensitiven Fluoreszenzfarbstofflösung für 1 h. Vor Licht schützen und vorsichtig drehen, um eine homogene Verteilung des Farbstoffs in den Zellen zu gewährleisten.
Ersetzen Sie die Lösung vor der Bildgebung durch frisches EM. Die Fluoreszenzbildgebung ist in Abbildung 1 dargestellt.
Aufnahme in einem Fluoreszenzmikroskop mit optischen Filtern für die Kalziumfluoreszenzbildgebung (Anregungspeak bei 488 nm, Emissionspeak bei 520 nm) unter Verwendung einer Kamera und Software, die in der Lage ist, die Intensität eines beliebigen Region of Interest (ROI) innerhalb des Sichtfelds des Mikroskops zu quantifizieren.

2. Elektrische Stimulation von Kulturen

HINWEIS: Der grundlegende Aufbau für die elektrische Stimulation ist in Abbildung 2 dargestellt. Ein Deckglas, auf dem die neuronale Kultur etwa 14 Tage lang gezüchtet wurde, wird in eine Petrischale unter ein Fluoreszenzmikroskop gelegt. Die elektrische Aktivität der Neuronen wird mit Hilfe von kalziumempfindlichen Farbstoffen abgebildet, während eine Spannung über zwei Paare von Badeelektroden angelegt wird, die außerhalb der Kultur positioniert sind. Die Elektroden werden von einem Signalgenerator angetrieben, dessen Ausgang durch einen Zweikanalverstärker verstärkt wird. Die Spannungsregelung zur Stimulation wird der eher standardmäßigen Stromregelung vorgezogen, da die elektrischen Feldvektoren direkt bestimmt werden und somit eine einfache Vektoraddition und -kombination ermöglicht wird. Dies erfordert eine sorgfältige Überprüfung der Gleichmäßigkeit des elektrischen Feldes, die für den Fall der Spannungsregelung über die gesamte Probe durchgeführt werden kann. Bei der Verwendung der Spannungsregelung sollte darauf geachtet werden, dass Erdschleifen vermieden werden, und die Homogenität des elektrischen Feldes sollte überprüft werden.

Für die elektrische Stimulation mit einem homogenen elektrischen Feld verwenden Sie ein Paar paralleler Elektrodendrähte.
1. Verwenden Sie Elektroden aus Platin mit einer Dicke in der Größenordnung von 0,005'' (127 μm). Wenn Sie mit den 13-mm-Deckgläsern verwendet werden, stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen den beiden Elektroden etwa 11 mm beträgt, und positionieren Sie die Elektroden 1 mm über der Kultur.
  HINWEIS: Verwenden Sie zur Herstellung des Elektrodenhalters (Abbildung 3A) Polytetrafluorethylen (PTFE). Bohren Sie schmale Löcher durch das PTFE, um die Elektroden einzuführen. Das Gerät sollte höher sein als die extrazelluläre Lösung, so dass das obere Ende, wo die Elektroden freiliegen, niemals mit der Lösung in Berührung kommt. Verwenden Sie zur Isolierung Epoxidkleber auf allen Teilen der Elektrodenleitungen, die freiliegen könnten.
2. Verwenden Sie eine quadratische Impulsform mit einer Einschaltdauer von 50 % ohne Gleichstromanteil, um Elektrolyse zu vermeiden. Variieren Sie die Pulsdauer zwischen 10 μs und 4 ms, um eine effektive Stimulation zu erzielen, ohne die Kultur zu verbrennen. Stellen Sie sicher, dass die Amplitude in der Größenordnung von ± 22 V liegt (siehe Abbildung 3). Der Rechteckimpuls kann an einem Oszilloskop beobachtet werden, das parallel zu den Elektroden geschaltet ist.
  Anmerkung: Für die einfache Programmierung jeder gewünschten Wellenform verwenden Sie eine handelsübliche Wellenformbearbeitungssoftware (siehe Materialliste). Geben Sie die gewünschte Wellenform grafisch ein und senden Sie sie an den Signalgenerator.
Um die Feldhomogenität zu testen, verwenden Sie eine Sondenelektrode. Verwenden Sie ein Raster von mindestens 1 mm x 1 mm, damit die Sonde im Bereich zwischen den Elektroden bewegt und das elektrische Potential gemessen werden kann.
1. Messen Sie das elektrische Potenzial. Verwenden Sie , um das elektrische Feld zu berechnen. Verwenden Sie eine der Elektroden als Referenzelektrode. Messen Sie das elektrische Feld mit unterschiedlichen Impulsdauern zwischen 100 μs und 4 ms (siehe Abbildung 3B für ein Beispiel für eine Impulsdauer von 100 μs), um sicherzustellen, dass das Feld innerhalb des Bereichs der Stimulationsdauer homogen ist.
  Anmerkung: In Abbildung 3D sehen Sie ein Beispiel für eine gemessene Homogenität des elektrischen Feldes bei einer Pulsdauer von 1 ms.

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Ergebnisse

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Abbildung 1: Beispielhafte Spuren von Calciumtransienten, die während synchroner Netzwerkausbrüche abgebildet wurden. Ein Bild von Neuronen, die vor dem Experiment mit einem Kalziumfarbstoff gefärbt wurden. B. Verwandte Spuren der Intensität in Abhängigkeit von der Zeit der ROIs in A, wobei die Farbe der Spur die Farbe des Randes der ROI in A darstellt. Ein starker Anstieg der Int...