Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein Magnetfeld

Zusammenfassung

Quelle: Stern, S., et al., Externe Anregung von Neuronen mit elektrischen und magnetischen Feldern in ein- und zweidimensionalen Kulturen. J. Vis. Exp. (2017)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Stimulation neuronaler Kulturen, die in einem gemusterten kreisförmigen Ring auf einem Deckglas gezüchtet wurden, unter Verwendung eines zeitlich veränderlichen Magnetfeldes.

Protokoll

>1. Vorbereitung von Deckgläsern für 1D-Kulturen.

1. Reinigen Sie Glasdeckgläser durch Eintauchen in eine Basis-Piranha-Lösung, die aus 75 mL DDW, 25 mL 25% Ammoniaklösung und 25 mL 30% Wasserstoffperoxid besteht. Legen Sie die Lösung mit den Glasdeckgläsern für 30 min bei ~ 50°C auf eine Heizplatte und trocknen Sie dann die Glasdeckgläser mit Stickstoff.
2. Zuerst werden Deckgläser mit einem dünnen Chromfilm (99,999 %) von 6 Å Dicke beschichtet, gefolgt von einer 30 Å Schicht aus Gold (99,999 %), entweder durch Aufdampfen oder Sputtern.
   1. Um eine Sputterrate von 0,05 – 1 Å /s zu erreichen, verwenden Sie eine Sputtermaschine mit 2 E-Beams und einem Vakuumsystem von 260 l/s mit den Zielgrößen 2" und 4". Verwenden Sie eine Rotationsstufe, die von 0 bis 100 Umdrehungen pro Minute (RPM) gehen kann. Verwenden Sie eine Gleichstrom-Sputterleistung (DC) von 0 bis 750 Watt.
   2. Um Plasma mit einem Druck von 10 mTorr in die Kammer zu bekommen, drehen Sie das Gerät mit 30 U/min und verwenden Sie Argon bei 99,999 %.
   3. Betreiben Sie die Stromversorgung der Sputterpistolen mit 40 W DC Sputterleistung für das Chrom, was zu einer Deckungsrate von ~ 0,12 Å/s führt, und mit 10 W DC Sputterleistung für das Gold, was zu ~ 0,28 Å/s führt.
3. 30 Minuten lang mit Ultraschall 0,1 g 1-Octadecanthiol in 100 mL ABS AR-Ethanol auflösen. Cr-Au-beschichtete Deckgläser 2 h in diese Lösung legen, dann mit Ethanol ABS AR waschen und mit Stickstoff trocknen.
4. Eine Lösung aus 100 mL Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (D-PBS) und 3,5 g eines Tri-Block-Copolymers (siehe Tabelle der Materialien/Reagenzien) wird durch Rühren für 1 - 2 h bei 600 - 700 U/min hergestellt. Legen Sie Deckgläser für 1 h in die Lösung. Deckgläser mit Stickstoff trocknen.
5. Ätzen Sie das gewünschte Muster mechanisch, indem Sie die Bio-Unterdrückungsschicht zerkratzen. Verwenden Sie dazu einen Stiftplotter, bei dem der Stift durch eine Ätznadel ersetzt wird. Kratzen Sie das Muster durch die Metallschichten, um das darunter liegende Glas zu erreichen. Steuern Sie diesen Prozess durch einen Computer, um ein repliziertes gewünschtes Muster zu erreichen. Die durch diesen Prozess gebildeten Muster sind in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt.
6. Bereiten Sie eine biokompatible Schicht aus 100 mL D-PBS, 3,5 g Tri-Block-Copolymer, 35,7 μl/ml Fibronektin und 29 μl/ml Laminin vor.
   1. Deckgläser mindestens 10 Min. in ultraviolettem Licht sterilisieren. Deckgläser über Nacht in der vorbereiteten biokompatiblen Lösung inkubieren.
      HINWEIS: Die biokompatible Schicht bildet sich nur dort, wo die Bioabstoßungsschicht im vorherigen Schritt abgeätzt wurde.
   2. Waschen Sie die Deckgläser am nächsten Tag zweimal mit P-DBS. Inkubieren Sie sie über Nacht in PM. Die Deckgläser sind nun bereit für die Zellbeschichtung.

>2. Pflege der neuronalen Kulturen.

1. Bereiten Sie das Wechselmedium (CM) vor, bestehend aus (pro ml): 0,9 mL MEM+3G, 0,1 mL HI HS, 10 μL 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUDR) mit Uridin 100x.
2. Bereiten Sie das Endmedium (FM) vor, bestehend aus (pro ml): 0,9 mL MEM+3G und 0,1 mL HI HS.
3. Ersetzen Sie PM durch 1-1,5 mL CM nach 4 Tagen in vitro (DIV). Ersetzen Sie bei 6 DIV 50 % des CM durch frisches CM. Bei DIV 8 wird das Medium auf 1,5 mL FM gewechselt, gefolgt von einer 50%igen Änderung von FM alle 2 Tage. Nach etwa einer Woche entsteht spontane synchrone Aktivität.

>3. Abbildung spontaner oder evozierter Aktivität in neuronalen Kulturen mit Fluoreszenzfarbstoffen.

1. Eine Lösung aus 50 μg calciumempfindlichem Fluoreszenzfarbstoff (siehe Tabelle der Materialien/Reagenzien) in 50 μl DMSO (Dimethylsulfoxid) herstellen.
2. Bereiten Sie eine extrazelluläre Aufzeichnungslösung (EM) vor, die (in mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-Glukose, 45 Saccharose (pH 7,4) enthält.
3. Inkubieren Sie die neuronale Kultur in 2 mL EM mit 8 μl der kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstofflösung für 1 h. Vor Licht schützen und vorsichtig drehen, um eine homogene Verteilung des Farbstoffs in den Zellen zu gewährleisten.
4. Ersetzen Sie die Lösung vor der Bildgebung durch frische EM. Die Fluoreszenzbildgebung ist in Abbildung 3 dargestellt.
5. Aufnahme in einem Fluoreszenzmikroskop mit optischen Filtern für die Kalziumfluoreszenzbildgebung (Anregungspeak bei 488 nm, Emissionspeak bei 520 nm) unter Verwendung einer Kamera und Software, die in der Lage ist, die Intensität eines beliebigen Region of Interest (ROI) innerhalb des Sichtfelds des Mikroskops zu quantifizieren.

>4. Magnetstimulation von Kulturen

Hinweis: Der grundlegende Aufbau für die Magnetstimulation ist in Abbildung 1 dargestellt. Oben rechts ist ein inverses Fluoreszenzmikroskop zu sehen, mit dem kalziumempfindliche Farbstoffe in den Neuronen abgebildet werden. Die Magnetspule (blaue Kreise) befindet sich etwa 5 mm konzentrisch über einer neuronalen Ringkultur (blauer Umriss). Eine Aufnahmespule (roter Kreis) am Umfang der Petrischale überwacht die durch den magnetischen Impuls induzierte Spannung. Oben links ist die gemessene Dynamik der magnetischen Stimulatorspule (MS) mit einer Kondensatorspannungsbelastung von 5.000 kV dargestellt, wie sie von der Tonabnehmerspule integriert wurde. Das induzierte elektrische Feld (berechnet für einen Ringradius von 14 mm) ist grün dargestellt, während das magnetische Feld blau dargestellt ist. Am unteren Rand sind Bilder der neuronalen Kultur zu sehen. Unten links ist ein Hellfeldbild eines gemusterten 24-mm-Deckglases zu sehen. Die weißen Bereiche sind die Neuronen. Das fotografierte Muster besteht aus konzentrischen Ringkulturen mit unterschiedlichen Radien. Unten rechts ist ein Zoom auf ein kurzes Segment der Ringe zu sehen, das einzelne Neuronen zeigt. Für eine Skala beträgt die Breite der Ringe etwa 200 μm.

1. Züchten Sie die Neuronen in einem kreisförmigen Ringmuster (geätzt wie in 1.5 beschrieben) für die 1D-Kulturstimulation. Verwenden Sie einen kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff für die Kalziumbildgebung (wie in Abschnitt 3 beschrieben) mit einer 1D-Kultur, die auf dünnen (170 μm), langen (10 mm) Linien strukturiert ist.
   1. Verwenden Sie eine kreisförmige Magnetspule und positionieren Sie eine Petrischale ca. 5 mm darunter und konzentrisch mit der Spule. Verwenden Sie eine kundenspezifische Spule von ca. 30 mm (Innendurchmesser, 46 mm Außendurchmesser) mit einer Induktivität von L = 90 mH, die von einem selbstgebauten oder kommerziellen MS mit einer maximalen Spannung von 5 kV angetrieben wird.
   2. Um neuronale Kulturen magnetisch zu stimulieren, werden eine Hochspannung und ein hoher Strom durch eine leitende Spule mit Hilfe eines Hochstrom-Hochspannungs-Schalters entladen. Der magnetische Stimulator (MS) kann mit großen Kondensatoren in der Größenordnung von 100 mF gebaut werden, um eine hohe Spannung von 1 - 5 kV zu erreichen. Alternativ können Sie ein handelsübliches MS verwenden (siehe Tabelle der Materialien/Reagenzien).
      Anmerkung: Verwenden Sie einen 0,254 mm dicken und 6,35 mm breiten polyesterbeschichteten rechteckigen Kupferdraht, um eine selbstgemachte Spule herzustellen. Drehen Sie Drähte auf maßgefertigte Rahmen, die mit Glasfasern isoliert und in Epoxidharz gegossen sind (siehe Tabelle der Materialien/Reagenzien). Alternativ können Sie handelsübliche Spulen verwenden (siehe Tabelle der Materialien/Reagenzien).

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Aufbaus für die Magnetstimulation von neuronalen Kulturen. Oben ist die Magnetspule (blaue Kreise) zu sehen, die sich 5 mm konzentrisch über der neuronalen Ringkultur befindet und in einer Petrischale platziert ist (blauer Umriss). Eine am Umfang der Petrischale positionierte Tonabnehmerspule (roter Kreis) misst die durch den magnetischen Impuls induzierte...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CaCl2 , 1M	Fluka	Artikel-Nr.: 21098	Extrazelluläre Aufzeichnungslösung
D-(+)-Glukose, 1M	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 65146	Beschichtungsmedium, extrazelluläre Aufzeichnungslösung
D-PBS	Sigma-Aldrich	Nr. D8537	Zellkulturen
Fibronektin	Sigma-Aldrich	Nr. F1141	Bio-Beschichtung
Fluo4, AM	Lebenstechnologien	Nr. F14201	Bildgebung spontaner oder evozierter Aktivität
FUDR	Sigma-Aldrich	Nr. F0503	Wechselndes Medium
Gentamycin	Sigma-Aldrich	Nr. G1272	Beschichtungsmedium, Wechselmedium, Endmedium.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	Nr. H0887	Extrazelluläre Aufzeichnungslösung
HI HS	bi	04-124-1A	Beschichtungsmedium, Wechselmedium, Endmedium
KCl, 3M	Merck	1049361000	Extrazelluläre Aufzeichnungslösung
Laminin	Sigma-Aldrich	Nr. L2020	Bio-Beschichtung.
MEM x 1	Gibco	Artikel-Nr.: 21090-022	Beschichtungsmedium, Wechselmedium, Endmedium
Magnesiumchlorid , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extrazelluläre Aufzeichnungslösung
NaCl, 4M	Bio-Labor	19030591	Extrazelluläre Aufzeichnungslösung
Octadecanthiol	Sigma-Aldrich	1858	Reinigung von Cr-Au-beschichteten Deckgläsern (1D-Kulturen)
Saccharose, 1M	Sigma-Aldrich	Nr. S1888	Extrazelluläre Aufzeichnungslösung
Uridin	Sigma-Aldrich	Nr. U3750	Wechselndes Medium
Sputtermaschine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Serie	Beschichtung von Glas mit dünnen Metallschichten
Stift-Plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Ätzen des Musters auf das beschichtete Deckglas
Stromversorgung	Matrix	MPS-3005 LK-3	Stromversorgung der Sputtermaschine
Epoxid	Cognis	Versamid 140	Gießen von hausgemachten Coils
Epoxid	Muschel	EPON 815	Gießen von hausgemachten Coils