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Messung der Live-Synaptischen Physiologie mit Multielektroden-Arrays (MEAs)
>1. MEAs für die Zellkultur vorbereiten.
- Reinigen Sie die Oberfläche jedes MEA 1 h lang mit 1 ml Reinigungsmittel. Spülen Sie es mit sterilem deionisiertem (DI) Wasser, spülen Sie es mit 70 % Ethanol, um es zu sterilisieren, und trocknen Sie es dann in einer Biosicherheitswerkbank unter UV-Licht an der Luft.
Anmerkung: MEAs können bis zur Verwendung in VE-Wasser bei 4 °C unter sterilen Bedingungen gelagert werden.
- Bereiten Sie eine 0,5 mg/ml-Lösung von Poly-Ornithin (PLO) vor, indem Sie 50 mg PLO in 100 ml Borsäurepuffer auflösen. Die Oberfläche jedes MEA mit 1 ml PLO bestreichen, um es hydrophil zu machen, und mindestens 4 Stunden lang bei 37 °C inkubieren. Entfernen Sie das PLO und waschen Sie die Oberfläche mit DI-Wasser.
- Verdünnen Sie die Beschichtungslösung der extrazellulären Matrix (ECM) mit basalen Medien (DMEM/F12), um eine Stammlösung von 1 mg/ml herzustellen. Um eine Arbeitslösung zu erhalten, resuspendieren Sie 3 mL ECM-Material in 33 mL vorgekühltes DMEM/F12-Medium, wodurch das Gesamtvolumen auf 36 mL für eine Konzentration von 80 μg/mL gebracht wird.
- Geben Sie 1 mL ECM-Arbeitslösung zu jedem MEA und inkubieren Sie mindestens 4 Stunden lang bei 37 °C.
- Entfernen Sie das ECM und legen Sie die Kugeln in 1,5 ml Medium auf eine MEA-Oberfläche, wobei Sie sicherstellen, dass die Kugeln auf dem Elektrodenarray positioniert sind (Abbildungen 1A, 1A'). Lassen Sie das Medium 2 Tage lang haften. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums alle 2-3 Tage (oder bei Bedarf öfter) und stellen Sie sicher, dass die Kugeln nicht gestört werden.
Anmerkung: Die Zugabe von Wachstumsfaktoren kann das Überleben und die Reifung der Kultur verbessern.
>2. Misst die elektrische Aktivität von neuronalen Kugeln.
- Richten Sie ein Multielektroden-Array-System (MEA) mit einem temperaturgesteuerten Kopftisch ein. Erstellen Sie ein Softwareprogramm mit einem 5-Hz-Hochpassfilter, einem 200-Hz-Tiefpassfilter und einem Spike-Schwellenwert von 5x Standardabweichung (SD).
- Platzieren Sie das MEA auf dem Kopftisch und zeichnen Sie die spontane elektrische Aktivität auf (Abbildung 1B, B'). Speichern Sie Rohdaten, einschließlich Spike-Frequenz und -Amplitude, für statistische Analysen.
Anmerkung: Ein Perfusionssystem kann mit dem MEA verwendet werden, um pharmakologische Wirkstoffe hinzuzufügen oder den Fluss frischer Medien für die Langzeitaufzeichnung zu erhöhen. Auf Wunsch kann eine zusätzliche Nachbearbeitung von Spikes durchgeführt werden.
