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>1. Ablation einer Subpopulation von Neuronen mit einem Zwei-Photonen-Lasermikroskop
HINWEIS: Wenn Benutzer planen, nach der Ablation eine Ca-Bildgebung durchzuführen, verwenden Sie die UAShspzGCaMP6s-Leitung. Wenn Benutzer planen, nach der Ablation eine Verhaltensaufzeichnung durchzuführen, verwenden Sie die UAS:EGFP-Linie, da die Ablation von EGFP-positiven Zellen einfacher durchzuführen ist als von GCaMP6s-exprimierenden Zellen.
- Beginnen Sie mit der Einrichtung der Paarung einer Gal4-Linie, die bestimmte zu untersuchende Neuronen markiert, und UAS:EGFP oder UAShspzGCaMP6s. Achten Sie darauf, den Perlmutthintergrund für beide Elternteile zu verwenden, damit Perlmutt-Homozygoten erhalten werden können.
Anmerkung: Homozygote Perlmutt enthalten keine Melanophoren auf der Körperoberfläche (Abbildung 1B). In der vorliegenden Studie werden eine Gal4-Linie gSAIzGFFM119B (die das Pretectum markiert) und eine weitere Gal4-Linie hspGFFDMC76A (die das ILH markiert) verwendet.
- Am folgenden Tag der Paarung sammeln Sie die Zebrafisch-Eier und heben sie in das Larvenstadium, wo die interessierenden Neuronen fluoreszierende Reporter exprimieren.
- Montieren Sie die Zebrafischlarve in 2 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Abbildung 1B).
- Beginnen Sie mit der Zubereitung einer 2%igen Agarose-Stammlösung: Lösen Sie 2 g Agarosepulver mit niedrigem Schmelzpunkt in 100 ml Systemwasser (d. h. das Wasser, das zur Konservierung erwachsener Zebrafische in einem zirkulierenden Wassersystem verwendet wird) oder E3-Wasser, indem Sie das Wasser in einer Mikrowelle auf den Siedepunkt erhitzen und kräftig mischen.
- Die Agarosebrühe mit einem niedrigen Schmelzpunkt von 2 % in der Mikrowelle erhitzen, bis sie kocht. Gießen Sie 3,5-4,0 ml der Agarose auf den Deckel einer 6 cm großen Petrischale. Warten Sie, bis die Agarose abgekühlt ist, damit sie sich warm anfühlt, bevor Sie fortfahren.
- Legen Sie als Nächstes eine einzelne Larve (bei diesem Schritt nicht betäubt) in die Agarose. Passen Sie die Position und Ausrichtung der Larve mit einer Präpariernadel so an, dass sie aufrecht steht (Abbildung 1C), bis die Agarose erstarrt, um die richtige Positionierung der Larve zu gewährleisten.
Anmerkung: Die Larve schwimmt weiter herum, während sich die Agarose verfestigt.
- Sobald die Larve positioniert ist, warten Sie 5 Minuten, bis sich die Agarose vollständig verfestigt hat.
- Gießen Sie 5 mL Tricainlösung (0,4 % bei 1x Arbeitskonzentration) über die Agarose.
Anmerkung: Um Bewegungen der Larven während der Laserablation zu vermeiden, müssen die Larven während des gesamten Ablationsverfahrens anästhesiert bleiben.
- Abtragen der Larve mit der Bleaching-Funktion in einem Zwei-Photonen-Lasermikroskopie-System.
- Legen Sie die in Agarose eingebettete Larve unter ein Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskop und starten Sie das Mikroskopiesystem.
- Starten Sie die Bilderfassungssoftware, und klicken Sie auf der Registerkarte "Laser" auf die Schaltfläche "Ein", um den Laser einzuschalten (Abbildung 1D). Warten Sie, bis sich der "Status" des Lasers von "Beschäftigt" in "Modusgesperrt" ändert.
- Stellen Sie auf der Registerkarte "Kanäle" die Wellenlänge des Lasers auf 880 nm (maximale Leistung: ca. 2.300 mW) für die EGFP-Ablation oder auf 800 nm (maximale Leistung: ca. 2.600 mW) für die GCaMP-Ablation ein.
- Wählen Sie das 20-fach-Objektiv aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen. Klicken Sie auf die Registerkarte "Orten", klicken Sie auf "GFP", um die Strahlengänge zu ändern, und betrachten Sie die Fluoreszenz direkt mit dem Auge.
- Lokalisieren Sie das Gehirn der Zebrafischlarve in der Mitte des Bildes und klicken Sie dann auf die Registerkarte "Erfassung", um zur Zwei-Photonen-Mikroskopie zurückzukehren.
- Als Aufzeichnung des Zustands "vor der Ablation" nehmen Sie ein Z-Stapel-Bild mit der 20-fachen Objektivlinse bei hoher Scangeschwindigkeit auf (um Hitzeschäden zu vermeiden). Vergleichen Sie später die Bilder, die vor und nach den Ablationsexperimenten aufgenommen wurden (Abbildung 2A). Um einen Z-Stack zu erhalten, klicken Sie auf "Z-Stack", um die Option "Z-Stack" auszuwählen und die Registerkarte zu erweitern. Legen Sie die untere Grenze fest (klicken Sie auf die Schaltfläche "Zuerst setzen"), nachdem Sie sich auf das ventrale Ende des Larvenhirns konzentriert haben, und stellen Sie die obere Grenze (klicken Sie auf die Schaltfläche "Zuletzt einstellen") ein, nachdem Sie sich auf die dorsale Oberfläche des Gehirns konzentriert haben. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Experiment starten", um die Z-Stack-Bildaufnahme auszuführen.
- Wählen Sie das 63X-Objektiv aus, indem Sie den Objektivrevolver manuell bewegen.
- Klicken Sie auf die Registerkarte "Lokalisieren", um zur Epifluoreszenzmikroskopie zu wechseln, lokalisieren Sie die Zellen, die mit dem Auge abgetragen werden sollen, in der Mitte des Bildes, und klicken Sie dann auf die Registerkarte "Erfassung", um zur Laserscanning-Mikroskopie zurückzukehren.
- Stellen Sie auf der Registerkarte "Erfassungsmodus" die "Frame Size" auf 256 x 256 ein. Klicken Sie auf "Live" und beobachten Sie die interessierenden Neuronen.
- Ausgehend von der dorsalen Seite finden Sie eine Fokusebene, in der die zu abtragenden Zellen fokussiert sind.
- Markieren Sie mit der Funktion "Regionen" einen kleinen, kreisförmigen Bereich von etwa einem Drittel der Zellgröße im Durchmesser auf jedem Neuron als Region of Interest (ROI).
- Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 13,93 s/256 x 256 Pixel (134,42 μm x 134,42 μm) ein, was einer Laserverweilzeit von ca. 200 μs/Pixel oder 200 μs/0,5 μm entspricht. Legen Sie außerdem 4 Wiederholungen fest ('Iterationszyklus: 4'). Alternativ können Sie die Anzahl der Iterationen und die Scangeschwindigkeit optimieren, sodass eine ausreichende Ablation erreicht wird.
- Führen Sie die Funktion "Bleichen" für die Ablation in Kombination mit den Funktionen "Zeitreihe (2 Zyklen)" zur Abbildung der Probe (vor und nach der Ablation) und "Regionen" (zum Festlegen der ROIs) oder gleichwertigen Funktionen in der verwendeten Software durch (Abbildung 1D).
- Durch den Vergleich des ersten Bildes (vor der Ablation) und des zweiten Bildes (nach der Ablation) im Zeitreihenzyklus stellen Sie sicher, dass die Fluoreszenz in den Zielzellen nach dem Bleichen auf das im Hintergrundniveau beobachtete abnimmt (Abbildung 2B).
- Wenn nach der Ablation immer noch Fluoreszenz vorhanden ist, erhöhen Sie die Anzahl der Iterationen.
- Verschieben Sie als Nächstes die Fokusebene etwas tiefer (d. h. in Richtung der ventralen Seite) und wählen Sie die nächste Fokusebene, in der nicht ablierte Zellen erscheinen.
- Führen Sie die Bleichfunktion wie oben beschrieben (Schritt 1.9) durch. Wiederholen Sie diese Schritte, bis alle Zellen in der interessierenden neuronalen Struktur abgetragen wurden.
- Nachdem Sie alle Fokusebenen durchlaufen haben, die die zu abtragenden neuronalen Strukturen abdecken, überprüfen Sie die Zellen auf aufgehobene Fluoreszenz. Wenn sich herausstellt, dass einige Zellen aufgrund unzureichender Ablation immer noch fluoreszieren, bestrahlen Sie sie erneut mit dem Laser, wie oben beschrieben.
- Wenn die Larve nach der Laserbestrahlung aus der Agarose geborgen werden muss, versuchen Sie nicht, sie aus der Agarose herauszudrücken, da dies die Larve beschädigen könnte. Machen Sie stattdessen vorsichtig winzige Schnitte in der Agarose um die Larve senkrecht zur Körperoberfläche. Warten Sie dann, bis die Larve von selbst aus der Agarose herausschwimmt, wenn das Anästhetikum nachlässt.
- Fahren Sie mit der nächsten Larve zur Ablation fort oder führen Sie Kontrollexperimente mit einer anderen Population von Neuronen durch, die nicht an dem untersuchten Verhalten beteiligt sind.
Anmerkung: Hier, als Kontrolle, Neuronen des Riechkolbens in UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B-Larven wurden mit dem oben beschriebenen Protokoll laserabliert (Abbildung 2A, rechts).
- Warten Sie mehrere Stunden oder 1 Tag für die Genesung, bevor Sie mit der Ca-Bildgebung (Abschnitt 2) oder der Verhaltensaufzeichnung (Abschnitt 3) fortfahren. Während dieser Erholungszeit überprüfen Sie den Gesundheitszustand der Larven (d. h. normales spontanes Schwimmen, keine offensichtlichen Hitzeschäden im abgetragenen Bereich usw.) und entfernen Sie Larven, die Anzeichen eines schlechten Gesundheitszustands aufweisen.
>2. Kalzium-Bildgebung zur Aufzeichnung der beuteevozierten neuronalen Aktivität in den Zebrafischlarven, die von Pretectums abliert wurden
- Um eine Aufnahmekammer vorzubereiten, legen Sie eine Dichtung der Hybridisierungskammer mit sicherer Abdichtung auf einen Objektträger, wobei die Klebeseite auf das Glas zeigt, und entfernen Sie die obere Dichtung.
Anmerkung: Dadurch entsteht eine kleine Aufnahmekammer mit einem Durchmesser von 9 mm und einer Tiefe von 0,8 mm (Abbildung 3A).
- Legen Sie anschließend ein Nylonnetz (Größe der Öffnung: 32 μm) auf ein 50-ml-Röhrchen, bei dem der untere Schnitt offen ist. Verwenden Sie die Kappe, um das Netz am Rohr zu befestigen (Abbildung 3B).
- Bereiten Sie die Pantoffeltierchen vor (die die Beute ist, die als visueller Reiz für die Larve verwendet werden soll).
Anmerkung: Bereiten Sie zuvor die Paramecium-Kultur vor (Schritte 2.3.1 und 2.3.2).
- Besorgen Sie sich im Voraus Paramezien-Saatgutkulturen aus kommerziellen Quellen oder akademischen Bioressourcenzentren.
- Kultivieren Sie das Pantoffeltierchen mehrere Tage lang in Wasser, das autoklaviertes Reisstroh und ein Pellet trockener Bierhefe enthält (Abbildung 3C).
- Gießen Sie die Pantoffeltierkultur nacheinander durch 2 Siebe (eines mit einer 150-μm-Öffnung, gefolgt von einem weiteren mit einer 75-μm-Öffnung), um Schmutz aus der Kultur zu entfernen.
- Sammeln Sie Pantoffeltiere im Durchfluss aus dem vorherigen Schritt auf einem Nylonnetz (13 μm Öffnung).
- Hängen Sie die Pantoffeltierchen auf dem Nylonnetz mit einer Quetschflasche mit Systemwasser wieder in ein Becherglas (Abbildung 3D).
- Spülen Sie das Netz (Abbildung 3B) 2x mit Systemwasser ab (Abbildung 3E).
Anmerkung: Der Zweck dieses Schritts besteht darin, alle möglichen Geruchs- und Geschmacksstoffe zu entfernen, die im Paramecium-Kulturmedium enthalten sind, da das Ziel der vorliegenden Studie darin besteht, die visuell gesteuerte neuronale Aktivität zu beobachten.
- Legen Sie eine Zebrafischlarve zur Betäubung in die Tricainlösung.
- Montieren Sie eine einzelne Larve in 2 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt.
- Zuerst 2% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in die Mikrowelle stellen und 1/10 Volumen 10x konzentriertes Tricain zur Agarose hinzufügen.
- Geben Sie einen Tropfen der Tricain-haltigen Agarose in die Aufnahmekammer (Abbildung 3A).
- Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass die Agarose nicht zu heiß ist, legen Sie die betäubte Larve (aus Schritt 2.5) in die Agarose und entfernen Sie sofort überschüssige Agarose, so dass die Oberfläche der Agarose leicht konvex aussieht.
- Richten Sie die Larve mit einer Präpariernadel schnell in eine aufrechte Position aus (Abbildung 1C).
Anmerkung: Diese Verfahren müssen innerhalb weniger Sekunden abgeschlossen sein, bevor sich die Agarose verfestigt.
- Sobald die Larve richtig positioniert ist, warten Sie 5 Minuten, bis sich die Agarose vollständig verfestigt hat. Gießen Sie dann einen Tropfen 1x Tricainlösung auf die Agarose.
- Entfernen Sie die Agarose um den Kopf der Zebrafischlarve und machen Sie mit einem chirurgischen Messer Platz für das Pantoffeltierchen, damit das Pantoffeltierchen schwimmen kann. Machen Sie dazu zunächst ein paar kleine Schnitte in die Agarose (Abbildung 3F). Entfernen Sie dann vorsichtig die überschüssige Agarose, indem Sie vorsichtig Systemwasser auf die Kammer gießen.
Anmerkung: Bei diesem Schritt wird das Tricain ausgewaschen.
- Legen Sie als nächstes ein Pantoffeltierchen in die Aufnahmekammer, um als visueller Stimulus zu dienen.
Anmerkung: Wenn das Pantoffeltierchen in der Nähe des Kopfes der Zebrafischlarve schwimmt, ruft es eine neuronale Reaktion hervor (Abbildung 3G).
- Stellen Sie die Aufnahmekammer unter ein Epifluoreszenzmikroskop, das mit einer wissenschaftlichen CMOS-Kamera ausgestattet ist (Abbildung 3H), und wählen Sie ein 2,5-faches Objektiv (Abbildung 3I).
- Sammeln Sie Zeitrafferaufnahmen der GCaMP-Fluoreszenzsignale.
- Starten Sie die Bildaufnahmeanwendung für die ausgerüstete Kamera.
- Klicken Sie auf "Sequenzbereich" und wählen Sie "Festplattenaufzeichnung" im Fenster. Stellen Sie im Abschnitt "Scan-Einstellungen" die "Frame-Anzahl" auf 900 oder eine andere gewünschte Gesamt-Frame-Anzahl ein.
Anmerkung: Falls verfügbar, verwenden Sie eine Zeitraffer-Aufnahmesoftware mit einem Modul (hier "Hard Disk Record"), das eine effiziente Speicherung der Daten auf einer Festplatte ermöglicht.
- Stellen Sie im Bereich "Aufnahme" die Belichtungszeit auf 30 ms (d. h. 33,3 fps) und das Binning auf 2 x 2 ein.
- Wählen Sie auf dem Touchpanel zur Steuerung des Mikroskops ein Filterset für GFP aus, da der GCaMP ähnliche Anregungs-/Emissionsspektren wie GFP aufweist.
- Klicken Sie im Aufnahmefenster auf "Live", um die Larve in der Kameraansicht zu lokalisieren und zu fokussieren (Abbildung 4A), und klicken Sie dann auf "Stop Live" und dann auf die Schaltfläche "Start". Speichern Sie den Film in .cxd oder einem anderen Format, das Informationen über die Aufnahmebedingung enthält.
