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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Elektrophysiologie
HINWEIS: Das Ziel dieses Protokolls ist es, Ganzzell-Stromklemmen-Aufzeichnungen von Pyramidenzellneuronen der Schicht II/III zu erhalten, die visuell durch GFP-Expression in GFP-elektroporierten Mausgehirnen (oder jedem anderen fluoreszierenden Protein, das zuvor elektroporiert wurde) identifiziert wurden. Mit diesem Protokoll ist es möglich, die Auswirkungen einer genetischen Veränderung, die durch IUE eingeführt wurde, auf die elektrischen Eigenschaften des Neurons zu untersuchen. Der Erwerb spezifischer Feuermoden ist ein allmählicher Prozess der Differenzierung, der die dynamische Expression eines breiten Repertoires von Ionenkanälen beinhaltet und der zur Expression transienter Feuermodi vor den späten postnatalen Stadien führt. Zum Beispiel werden reife elektrische Reaktionen in den Schichten II/III des somatosensorischen Mauskortex vor P16 nicht beobachtet.
- Voraussetzungen für die akuten Schnitte
- Bereiten Sie 1 l ACSF mit hochreinem (doppelt destilliertem Wasser) zu, das 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM Glukose, 2,5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2 und 1 mM NaH2PO4 enthält. Titrieren Sie den pH-Wert auf 7,3 - 7,4 mit HCl oder NaOH. Stellen Sie die Osmolarität auf 290 mOsm ein.
- Bubble ACSF mit Carbogen (95%Ø 2/5% CO2) für 15 - 20 min mit Teflonschläuchen (~ 1 mm), um den pH-Wert auf 7,3 - 7,4 zu stabilisieren.
- Voraussetzungen für die Ganzzellaufzeichnung
- Stellen Sie sicher, dass die Elektrophysiologie-Station mit einer Aufnahmekammer, einem Perfusionssystem, einem Mikroskop, Elektroden (Aufnahme-, Stimulations- und Erdungselektroden), Makro- und Mikromanipulatoren, einem stabilen, vibrationsfesten Tischgerät und Faradayschen Käfig, einem Stimulator, einem Verstärker und einem Analog-Digital-Wandler (A/D), einem Computer mit Erfassungssoftware und einem GFP-Filter (oder einem anderen Fluorochrom) zur Analyse genetisch veränderter Neuronen ausgestattet ist (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie die intrazelluläre Lösung vor, die 115 mM Kaliumgluconat, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mM Na2ATP und 0,3 mM Na3GTP enthält, eingestellt auf pH 7,2 durch KOH und auf 290 mOsm durch KCl.
- Stellen Sie Patch-Pipetten her, indem Sie Kapillaren aus Borosilikatglas ziehen. Bereiten Sie die Patch-Elektroden mit einem Mikropipettenabzieher vor. Verwenden Sie Borosilikatkapillaren (1,5 mm Außendurchmesser, 0,86 mm Innendurchmesser, 10 cm Länge). Stellen Sie Patch-Elektroden her, die Widerstände von 3-10 MΩ aufweisen, wenn sie mit intrazellulärer Lösung gefüllt sind.
- Die Aufnahmekammer mit ACSF mit einer Geschwindigkeit von 2 ml/min perfundieren. Die Temperatur der Kammer bei ca. 33 °C halten.
- Aufzeichnung ganzer Zellen
- Übertragen Sie die Scheiben mit einer Pasteur-Pipette (schneiden Sie die lange Spitze ab) oder einem kleinen Pinsel in die Aufnahmekammer. Halte die Scheibe mit einer Harfe fest. Perfundieren Sie die Scheiben ständig mit ACSF mit einer Geschwindigkeit von 2 mL/min.
- Patchen Sie ein GFP-positives Neuron.
- Legen Sie die Scheibe in die Aufnahmekammer und suchen Sie den interessierenden Bereich durch das Mikroskop bei geringer Vergrößerung (10-fach). Suchen Sie dann eine GFP-positive Zelle, die Sie mit dem 60x-Objektiv patchen können.
- Füllen Sie die Aufzeichnungselektrode mit intrazellulärer Lösung. Verwenden Sie die mit dem Filter verbundene Spritze (4-mm-Filter) und die Mikroladerspitze, um die Aufzeichnungselektrode mit intrazellulärer Lösung zu füllen.
- Legen Sie die Glaspipette in den Pipettenhalter. Legen Sie die Pipettenspitze in die Badewanne und fokussieren Sie sich auf die Spitze. Sobald sich die Pipette im Bad befindet, üben Sie über das Gegendruckkontrollsystem Überdruck aus.
- Patchen Sie ein Neuron, das fluoreszierend ist (Abbildung 1B).
- Nähern Sie sich der interessierenden Zelle unter visueller Führung, während Sie den Gegendruck in der Pipette aufrechterhalten. Wenn ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche erscheint, lassen Sie den Druck ab. An dieser Stelle kann sich eine dichte Abdichtung (Widerstand größer als 1 GΩ) bilden. Andernfalls üben Sie einen leichten Unterdruck (Sog) aus, um dies zu erleichtern.
- Während die Dichtung gebildet wird, bringen Sie die Haltespannungsklemme auf -60 mV. Sobald die GΩ-Versiegelung gebildet ist, wenden Sie einen Saugimpuls an, um die Zellmembran unter der Pipette zu durchbrechen und in den Ganzzellmodus zu wechseln.
- Zeichnen Sie die Aktivität unter Verwendung von Stromzangenbedingungen auf. Sobald Sie sich im Ganzzellenmodus befinden, wechseln Sie vom Voltage-Clamp- in den Current-Clamp-Modus und starten Sie die Aufnahme. Um beispielsweise die Erregbarkeit der Zellen aufzuzeichnen, wenden Sie 500 ms lange Depolarisationsstrominjektionen (100 - 400 pA) an.
- Berechnen Sie die Zündraten, indem Sie die Anzahl der Aktionspotentiale entlang des Zuges für die Erhöhung der Eingangsströme darstellen.
Anmerkung: Das Ruhemembranpotential, der Eingangswiderstand und die Membrankapazität können ebenfalls aus den Aufzeichnungen berechnet werden.
