Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Ferkel und Ferkelhandhabung
- Männliche und weibliche Ferkel systematisch und zufällig einsetzen, um potenzielle geschlechtsspezifische Störfaktoren gemäß den ARRIVE-Richtlinien zu eliminieren.
HINWEIS: Da die Periode des maximalen Gehirnwachstums innerhalb von 3-5 Tagen nach der Ferkelgeburt liegt, werden die Experimente nur mit Ferkeln durchgeführt, die 3-5 Tage alt sind.
- Stellen Sie sicher, dass die Ferkel mindestens 24 Stunden vor dem Versuch im Vivarium ankommen, damit sie sich an die Umgebung gewöhnen können.
Anmerkung: Geschultes tierärztliches Personal sorgt für die routinemäßige Tierpflege. Die Ferkel werden in individuell temperierten, kontinuierlich überwachten Käfigen gehalten und erhalten einen ernährungsphysiologisch vollständigen Milchaustauscher ad libitum, um eine Hypoglykämie zu verhindern. Die Ferkel werden außerdem mindestens 3 Stunden vor der Anästhesie ohne Milchersatz (null pro os) gehalten und mit Decken und Spielzeug versorgt, um ein normales Stimulationsniveau zu gewährleisten. Wenn möglich, halten Sie mehrere Ferkel im selben Käfig, um die Sozialisierung zu ermöglichen.
>2. Entwicklung und Anpassung von Mikroelektrodenarrays (MEAs) für anästhesieinduzierte Neurotoxizität (AIN) Studien in einem Ferkelmodell
HINWEIS: Diese Technologie verwendet enzymbasierte MEAs, die mit Enzym vorbeschichtet und mit m-Phenylendiamindihydrochlorid (mPD) galvanisiert sind. Die Elektroden wurden speziell für den Einsatz in Ferkeln entwickelt und für den Einsatz in Ferkeln hergestellt (Abbildung 1).
- Bitte beachten Sie die detaillierte Beschreibung der MEA-Vorbereitung und -Kalibrierung (Abbildung 2).
>3. Anästhesie und Verwendung eines speziellen stereotaktischen Apparats für das Ferkel
- Betäuben Sie die Tiere mit einem Anästhesiearbeitsplatz mit einem geeigneten Beatmungsgerät und Überwachungsgeräten und überwachen Sie physiologische Parameter wie Pulsoximetrie, nicht-invasiven Blutdruck, Elektrokardiographie und Temperatur während des gesamten Experiments, wie zuvor beschrieben. Intubieren und beatmeten Sie die Ferkel und verabreichen Sie eine Sevofluran-Anästhesie bei 1 minimaler Alveolarkonzentration (MAC) (ca. 2,5-3%) für 3,5 h. Stellen Sie sicher, dass geschultes Laborpersonal für diese Experimente anwesend ist. Das Fell, das über dem Operationsgebiet liegt, wird vor der Präparation der Haut mit einer elektrischen Schermaschine entfernt.
Anmerkung: Die Konzentration und Dauer des verwendeten Anästhetikums ermöglicht es dem Experiment, die Zeit-Länge der tatsächlichen Anästhesieexposition während eines chirurgischen Eingriffs zu simulieren. Darüber hinaus ist Sevofluran das am häufigsten verwendete Vollnarkosemittel in der pädiatrischen Bevölkerung, so dass die Untersuchung seiner Sicherheit von größter Bedeutung ist.
- Vor dem Einsetzen in den stereotaktischen Rahmen ist mit einer Rocuronium-Aufsättigungsdosis von 2,5 mg/kg und einer Infusion von 1,5 mg/kg/h zu beginnen, um eine Bewegung des Tieres zu verhindern, während es im Rahmen gesichert ist.
- Setzen Sie das Ferkel in den ferkelspezifischen stereotaktischen Rahmen, sobald eine ausreichende Anästhesietiefe durch Zehenkneifen bestätigt wurde.
- Sorgen Sie für eine angemessene Polsterung innerhalb des stereotaktischen Rahmens, indem Sie das Ferkel auf ein Umluft-Wärmekissen mit zusätzlicher Polsterung (z. B. fluidisierter Positionierer) legen, um Druckgeschwüre zu vermeiden.
- Platzieren Sie die Zähne des oberen Unterkiefers über dem Zahnsteg (Bild 3).
Anmerkung: Die Zahnstange sollte auf einer ausreichenden Höhe sein, um den Schädel sehr fest an Ort und Stelle zu halten.
- Fixieren und ziehen Sie die eindringenden Ohrstangen in den Ohren fest und achten Sie darauf, dass sich das Ferkel in der Mittellinienposition befindet. Positionieren Sie die spitzen Spitzen der seitlichen Griffe im Gehörgang und führen Sie die Ohrbügel fest genug ein, um das "Knall"-Geräusch zu hören, das mit der Durchdringung des Trommelfells verbunden ist. Befestigen Sie die Ohrbügel fest am Schädel und setzen Sie sie auf jeder Seite gleich tief ein, um eine Bewegung des Schädels während des Experiments zu verhindern (Abbildung 4, Tafel A).
Anmerkung: Es ist von entscheidender Bedeutung, das Ferkel warm zu halten (~ 37,8-38,6 °C) und die Temperatur während des gesamten Eingriffs kontinuierlich zu überwachen, um die Normothermie zu erhalten. Dies kann über eine Decke und/oder eine Wärmelampe erfolgen. Stellen Sie die Wärmelampe in angemessenem Abstand auf, um Verbrennungen der Haut des Tieres zu vermeiden.
- Machen Sie einen 4-6 cm langen Schnitt in der Mittellinie entlang des Schädels und achten Sie darauf, dass der Schädel nicht mit dem Skalpell eingeritzt wird. Sobald der Schnitt gemacht ist, verwenden Sie eine sanfte Retraktion und eine stumpfe Dissektion, um die Kopfhaut vom Schädel abzuheben. Schrubben Sie den Schädel vorsichtig mit einem Mullkissen, um jegliches Bindegewebe zu entfernen und die Nahtlinien freizulegen (Abbildung 4, Tafel B).
Anmerkung: Es ist nicht notwendig, die Sterilität während der Experimente ohne Überleben aufrechtzuerhalten. Die Sterilität muss jedoch während der Überlebensexperimente aufrechterhalten werden.
- Reflektieren Sie bei Bedarf die Kopfhaut weiter, um den interessierenden Bereich freizulegen und die vorgesehene Stelle für die Kraniotomie zu bestimmen (Abbildung 5, Panel A). Verwenden Sie einen chirurgischen Bohrer, um ein Kraniotomiefenster von ca. 0,25 cm2 (kann je nach experimentellem Ziel größer oder kleiner sein) über der interessierenden Struktur zu erstellen, und achten Sie darauf, die Dura oder das darunter liegende Gehirn nicht zu verletzen (Abbildung 5, Panel B). Verwenden Sie eine feine chirurgische Schere, um die Dura über dem Hirngewebe zu entfernen (Abbildung 5, Panel C).
- Positionieren Sie die Elektrode so senkrecht wie möglich über dem Bregma, indem Sie den Metallarm des Kopftisches am Mikromanipulator des Ferkelstereotax befestigen. Senken Sie die Elektrode so weit wie möglich ab, ohne die Oberfläche des Schädels zu berühren. Notieren Sie die Koordinaten des Bregmas (Abbildung 6, Panel A).
- Bestimmen Sie die anterior-posterioren und medial-lateralen Koordinaten sowie die Tiefe der interessierenden Struktur, die sich auf das Bregma bezieht. Bestimmen Sie die stereotaktischen Koordinaten mit Hilfe eines art- und altersgerechten stereotaktischen Atlas. Verwenden Sie in diesem Fall einen stereotaktischen Atlas, der speziell für Ferkel entwickelt wurde.
- Positionieren Sie die Elektrode so, dass sie die richtige anterior-posteriore und medial-laterale Position hat, und stellen Sie sicher, dass sowohl die Mikroelektrode als auch das Gerät senkrecht zur Oberfläche stehen. Die Pseudo-Referenzelektrode unter der Kopfhaut platzieren und dabei den Kontakt mit dem Tier sicherstellen (Abbildung 6, Tafel B).
- Senken Sie die Elektrode langsam und vorsichtig mit dem stereotaktischen Arm bis zur entsprechenden Tiefe in das Gehirn ab. Verwenden Sie für die letzten 2 mm einen hydraulischen Mikroantrieb, um die Elektrode weiter an die genaue Stelle zu treiben (Abbildung 6, Tafel C).
Anmerkung: Die Elektrodenposition sollte über dem Kraniotomiefenster liegen. Die Elektrodentiefe variiert je nach der interessierenden Gehirnstruktur. Es ist nicht notwendig, den Schnitt nach Abschluss der Datenerhebung in Nicht-Überlebensexperimenten zu schließen.
>4. Messung von extrazellulärem Glutamat unter Sevofluran-Anästhesie
- Stellen Sie sicher, dass das Ferkel während des gesamten Verfahrens unter kontinuierlicher physiologischer Überwachung steht. Die Ferkel werden zur Vorbereitung auf den Eingriff inhalativ (über einen Gesichtskegel) betäubt.
- Warten Sie nach der Implantation der MEA 30 Minuten, bis die Elektrode den Ausgangswert erreicht hat, um sicherzustellen, dass 3 Stunden lang eine korrekte Messung durchgeführt wird (Abbildung 7).
- 0,25 % Bupivacain (1 ml/kg) werden zur postoperativen Schmerzbehandlung subkutan an der Operationsstelle verabreicht. Zusätzlich wird Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung bei Bedarf alle 72 Stunden subkutan verabreicht.
