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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der entsprechenden tierethischen Überprüfung überprüft und genehmigt.
>1. Lösungen für chirurgische und experimentelle Aufzeichnungen
- Bereiten Sie einen normalen künstlichen Puffer für die Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) vor, der (mM) NaCl (Natriumchlorid) 124, KCl (Kaliumchlorid) 3,75, KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) 1,25, MgSO4 (Magnesiumsulfat) 2, NaHCO3 (Natriumbicarbonat) 26, Dextrose 10 und CaCl2 (Calciumchlorid) 2 enthält. Verwenden Sie dieses normale aCSF für die Gewebewiederherstellung nach der Dissektion und für das Waschsystem zu Beginn des Experiments.
- Bereiten Sie Saccharose aCSF vor, das während der Hippocampus-Dissektion verwendet wird und (mM) enthält: Saccharose 220, KCl 2,95, NaH2PO4 (Natriumdihydrogenphosphat) 1,3, MgSO4 2, NaHCO3 26, Dextrose 10 und CaCl2 2. Um eine epileptiforme Aktivität in der intakten Hippocampus-Gewebepräparation zu induzieren, fügen Sie 4-Aminopyridin (4-AP) zu normalem aCSF in einer Konzentration von 100 μM hinzu.
>2. Platzieren des entfalteten Hippocampus auf dem penetrierenden Mikroelektrodenarray (PMEA) zur Aufzeichnung der neuronalen Aktivität
- Zur Vorbereitung des Versuchsaufbaus wird eine Flasche mit normalem aCSF und eine weitere Flasche mit 4-AP aCSF gefüllt. In beiden Flaschen Blasen Sie 95 % O2 / 5 % CO2 von Beginn jedes Experiments an. Verwenden Sie einen Dreiventil-Stecker, um zu steuern, welche Lösung während eines Experiments ausgewählt wird. Schließen Sie einen Vakuumschlauch am Ausgang der Kammer an, um die Lösung in einen Staubbehälter zu pumpen. Erhitzen Sie die Rohrleitung, bevor Sie sie in die Aufnahmekammer leiten, und halten Sie die Lösung auf einem kontrollierten Temperaturniveau (35 °C).
- Wenn der Einlass und der Auslass der Aufnahmekammer geschlossen sind, verwenden Sie eine speziell angefertigte Glaspipettenpipette, um den entfalteten Hippocampus in die Kammer zu übertragen und zu platzieren. Positionieren Sie unter dem Mikroskop den entfalteten Hippocampus mit einem normalen kleinen Pinsel, während das Gewebe in der Lösung schwimmt. Platzieren Sie den entfalteten Hippocampus mit der Alveusseite nach unten, wobei der CA3-Bereich weg und das CA1-Feld in Richtung des Forschers zeigt.
- Saugen Sie die Lösung in der Kammer vorsichtig mit einer Vakuumpipette vom Rand der Aufnahmekammer ab, um den Lösungsstand zu senken, bis die Kammer getrocknet ist und das Gewebe auf das Array abgesenkt wird. Platzieren Sie dann vorsichtig einen speziell angefertigten Gewebeanker (Abbildung 1) (Nr. 7 in Spezifische Materialien und Ausrüstungen) auf dem Gewebe, um den entfalteten Hippocampus auf dem Array zu halten. Geben Sie ein paar Tropfen Lösung in die Aufnahmekammer, um sie wieder zu füllen, und öffnen Sie nach und nach den Einlass und Auslass, um die Durchflussrate in der IV-Tropfkammer auf etwa zwei Tropfen pro Sekunde einzustellen.
- Inkubieren Sie das Gewebe in der Aufnahmekammer etwa 1 Minute lang mit normalem aCSF, um sich zu erholen, schalten Sie dann die Lösungszufuhr auf 4-AP gelösten aCSF um und stellen Sie die Flussrate richtig ein. Inkubieren Sie das Gewebe etwa 5 bis 10 Minuten lang in gelöstem 4-AP-aCSF, und dann könnte der Forscher die Software starten, um das Signal aufzuzeichnen, wenn spontane Aktivität auftritt.
