Vorbereitung eines Rattenmodells zur Beurteilung der Integrität der Sehbahn unter Verwendung eines elektrophysiologischen Aufbaus

Abstract

Quelle: Nguyen, C. T. et al., Gleichzeitige Aufzeichnung von Elektroretinographie und visuell evozierten Potentialen bei anästhesierten Ratten.J. Vis. Exp. (2016)

Dieses Video zeigt die Vorbereitung eines Rattenmodells zur Untersuchung der Netzhautgesundheit und der Integrität der Sehbahn. Visuell evozierte Potential- und Elektroretinographie-Referenz- und aktive Elektroden werden mit der Ratte verbunden, gefolgt von der Ausrichtung der Plattform mit der Ratte vor der Ganzfeld-Schale für eine gleichmäßige Netzhautbeleuchtung und dem Schließen des Faradayschen Käfigs, um externe Störungen zu vermeiden.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Präimplantation von Elektroden mit chronischem visuellem evoziertem Potential (VEP)

HINWEIS: Wenn gleichzeitig Elektroretinogramm (ERG) und VEP-Signale gesammelt werden sollen, müssen den Tieren mindestens 1 Woche vor der Signalentnahme VEP-Elektroden chirurgisch implantiert werden.

1. Sterilisieren Sie den Operationstisch vor dem Experimentieren durch Reinigung mit Chlorhexidin (0,5 % in 70 % Ethanol). Autoklavieren Sie alle chirurgischen Geräte vor dem Gebrauch. Decken Sie das Tier mit einem sterilisierten OP-Tuch ab. Stellen Sie sicher, dass alle Experimentatoren chirurgische Masken, Kittel und sterilisierte Handschuhe tragen.
2. Induzieren Sie die Anästhesie mit 3 - 3,5 % Isofluran mit O₂ bei einer Flussrate von 3 l/min. Halten Sie die Anästhesie während der gesamten Operation bei 1,5 % und 2 l/min. Sorgen Sie für eine ausreichende Narkosetiefe durch das Fehlen eines Pfotenkneifreflexes.
3. Tragen Sie 1% Carboxymethylcellulose-Natrium auf die Hornhaut auf, um ein Austrocknen der Augen zu verhindern.
4. Rasieren Sie einen 30 mm x 30 mm großen Bereich über der Stirn, hinter den Augen und vor den Ohren.
5. Legen Sie das Tier auf ein Wärmekissen (37 °C), um die Körpertemperatur zu halten und den Kopf des Tieres mit einem stereotaktischen Rahmen zu stabilisieren.
6. Desinfizieren Sie die rasierte Stelle dreimal mit 10% Povidon-Jod. Vermeiden Sie für den Bereich in der Nähe des Auges die Verwendung von Antiseptika auf Alkoholbasis, die dem von der Association of Surgical Technologists festgelegten Praxisstandard entsprechen.
7. Machen Sie mit einem Skalpell einen median-sagittalen Schnitt am Kopf und exzisieren Sie daraus einen Kreis aus Hautgewebe mit einem Durchmesser von ~ 20 mm, um den Schädelknochen freizulegen.
8. Entfernen Sie das darunterliegende Periost, indem Sie es abkratzen und mit Gaze trocknen, um die koronalen und sagittalen Schädelnähte freizulegen.
9. Mit einem Zahnfräser, der an einem Bohrer befestigt ist, wird an beiden Hemisphären bei den stereotaktischen Koordinaten zwei Löcher (0,7 mm Durchmesser, Tiefe ~ 1 mm) durch den Schädel gebohrt: 7 mm kaudal bis bregma, 3 mm lateral bis zur Mittellinie.
10. Schrauben aus Edelstahl (Durchmesser 0,7 mm, Länge 3 mm, mit Chlorhexidin sterilisiert) in die beiden vorgefertigten Löcher bis zu einer Tiefe von ~ 1 mm (2 mm der Schraube freiliegend) eindrehen, um eine feste Verankerung zu ermöglichen. Dadurch kommt die Dura in Kontakt, ohne das darunter liegende kortikale Gewebe zu beschädigen.
11. Bereiten Sie den Operationsbereich für das Zahnamalgam vor, indem Sie den Schädelknochen mit Gaze trocknen und die lose Haut mit zwei 3 - 0 Nähten bei ~ 4 und 8 Uhr zurückziehen.
12. Verteilen Sie Zahnamalgam auf dem freiliegenden Schädel, um die Schraubenelektroden (Edelstahlschrauben, die in Schritt 1.10 beschrieben sind) an Ort und Stelle zu halten. Stellen Sie sicher, dass ~ 1,5 mm der Schrauben für die Aufnahme freiliegen.
13. Entfernen Sie die Retraktionsnähte.
14. Injizieren Sie 0,5 % Carprofen subkutan (5 mg/kg) zur Analgesie und Kochsalzlösung (Natriumchlorid 0,9 %, 1,5 ml) subkutan zum Flüssigkeitsersatz.
15. Lassen Sie die Tiere sich in getrennten Käfigen erholen. Lassen Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten.
16. Geben Sie das Tier nicht in die Gesellschaft anderer Tiere zurück, bis es sich vollständig von der Operation erholt hat (mindestens 5 Tage).
17. Verabreichen Sie weiterhin 0,5% Carprofen subkutan zur Analgesie (5 mg/kg) einmal täglich für 4 Tage.
18. ERG und VEP 1 Woche nach der Operation aufzeichnen.

>2. ERG- und VEP-Aufzeichnung

1. Vorbereitung der Datenerhebung
   1. Verwenden Sie Computersoftware, um gleichzeitig einen Stimulus auszulösen und Daten gemäß den unten empfohlenen Einstellungen zu erfassen.
      1. Verstärken Sie die Signale (ERG: ×1.000, VEP: x10.000), wobei die Verstärkung intern durch einen isolierten Vorverstärker und Verstärker eingestellt wird und beide Augen auf die Impedanz abgestimmt sind.
      2. Stellen Sie die Abtastrate für das ERG über ein Aufnahmefenster von 650 ms (2.560 Punkte) auf 4 kHz ein. Klicken Sie dazu in der Datenerfassungssoftware auf die Registerkarte "Zeitbasis" (Name und Version der Software siehe Tabelle für Materialien), wählen Sie "2.560" für Samples und "500 ms" für die Zeit, die ein Aufnahmefenster von 650 ms zurückgibt.
         1. Verwenden Sie die gleiche Methode, um die Abtastrate für den VEP über einen Zeitraum von 250 ms auf 10 kHz festzulegen. Ermöglichen Sie eine Pre-Stimulus-Baseline von 10 ms sowohl für ERG- als auch für VEP-Aufnahmen. Klicken Sie dazu auf die Registerkarte "Setup"; Wählen Sie "Stimulator", um ein neues Dialogfenster aufzurufen; Wählen Sie in diesem Fenster "Pulse" aus der Dropdown-Liste für "Modus"; und setzen Sie den Wert für "delay" auf "10 ms".
      3. Stellen Sie die ERG-Bandpassfilterung auf 0,3 - 1.000 Hz (- 3 dB) ein. Klicken Sie dazu in der Datenerfassungssoftware auf "Bio Amplifier". Stellen Sie dann den Wert für "High Pass" auf "0,3Hz" und den Wert für "Low Pass" auf "1 kHz" ein.
      4. Unter Verwendung der oben genannten Methode in 2.1.1.3 stellen Sie die VEP-Bandpass-Einstellungen auf 0,1 - 100 Hz (- 3 dB) ein, wie von der International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) für menschliche VEP-Aufzeichnungen empfohlen.

>2. Elektrodenvorbereitung

1. Stellen Sie die aktiven/inaktiven ERG- und die aktiven/inaktiven VEP-Elektroden individuell her, indem Sie Silberdraht bzw. eine Krokodilklemme an einer Elektrodenleitung anbringen. Kommerziell erhältliche Erdungselektrode.
2. Für die 4 maßgefertigten Elektroden schneiden Sie das männliche Ende von der Elektrodenverlängerung ab. Entfernen Sie 1 cm der äußeren Isolierschicht aus Polytetrafluorethylen mit einer Skalpellklinge, um sicherzustellen, dass der innere Draht nicht beschädigt wird.
3. Forme die inaktiven ERG-Elektroden vor, indem du ein 70 mm langes Stück Silberdraht (0,3 mm Dicke) abschneidest und eine Schlaufe mit einem Durchmesser von ~ 8 mm bildest, um das Rattenauge zu umschließen. Bereiten Sie einen gleichmäßigen Kreis vor, indem Sie die Schlaufe auf einer 1-ml-Pipettenspitze formen.
4. Pre-fashion-inaktive VEP-Elektroden, indem Sie ein 70 mm langes Stück Silber schneiden und eine Ellipse mit einem Längsdurchmesser von ~ 8 mm bilden, um sie an Rattenschneidezähnen einzuhaken.
5. Bereiten Sie die aktiven ERG-Elektroden vor, indem Sie ein 30 mm langes Stück Silberdraht abschneiden und eine kleine Schlaufe bilden, um die Hornhaut der Ratte (~ 1-2 mm Durchmesser) sanft zu berühren
6. Befestigen Sie die Elektroden (2 ERG aktiv, 2 ERG inaktiv, 1 VEP inaktiv) sicher an der Elektrodenleitung, indem Sie das Silber mit dem freiliegenden Innendraht verflechten.
7. Isolieren Sie überschüssiges freiliegendes Metall mit Klebeband, um photovoltaische Artefakte zu reduzieren.
8. An den ERG-Inaktivelektroden kleben Sie ein kleines Stück Klettverschluss (~ 5 mm × 20 mm) auf das Kreppband, um eine stabile Befestigung am Nager-Halsband zu ermöglichen.
9. Befestigen Sie die Krokodilklemme am Innendraht der Elektrodenleitungen, um die VEP-Elektroden aktiv zu machen.
10. Vor der Aufnahme werden die freiliegenden Oberflächen der Silberdrähte (d. h. der inaktive Ring und die aktive Spitze) mit einer 9-V-Gleichstromquelle 20 Sekunden lang mit Chlorid galvanisiert, um die Signalleitung zu verbessern.
    1. Tauchen Sie dazu die silberne Spitze des ERG-Elektrodendrahtes (der als Anode einer Primärzelle fungiert) in normale Kochsalzlösung und verbinden Sie das andere Ende dieses Elektrodendrahtes mit dem Pluspol einer 9-V-Batterie.
    2. Verbinden Sie einen weiteren Draht (die Kathode) mit dem Minuspol der Batterie und tauchen Sie das andere Ende ebenfalls in Kochsalzlösung. Trennen Sie die Verbindung nach 20 Sekunden und beobachten Sie, wie die silberne Spitze des ERG-Elektrodendrahtes gleichmäßig mit weißer Farbe beschichtet wird.
       HINWEIS: Bereiten Sie für jede Versuchssitzung (~ bis zu 8 Stunden) neue ERG-Elektroden vor, um die Durchgängigkeit der Chloridbeschichtung sicherzustellen.

>3. Vorbereitung der Tiere

1. Passen Sie die Tiere über Nacht (≥ 8 Stunden) an die Dunkelheit an, bevor Sie in einem lichtdichten Raum aufnehmen. Sorgen Sie für eine maximale Anpassung an die Dunkelheit, indem Sie die Raumbeleuchtung ausschalten und alle Türen und Jalousien schließen. Minimieren Sie den Lichtverlust, indem Sie lichtdichte Materialien um Verbindungsstellen von Türen/Fenstern platzieren und Computerbildschirme außerhalb dicker schwarzer Vorhänge platzieren.
2. Die Tierpräparation in einem dunklen Raum mit Hilfe einer schwachen roten Leuchtdiode (LED; 17,4 cd.m-2, λ_max = 600 nm) durchführen, um die Empfindlichkeit der Stäbchen aufrechtzuerhalten.
3. Betäuben Sie die Ratte durch intramuskuläre Injektion von Ketamin/Xylazin (60: 5 mg/kg). Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesietiefe durch das Fehlen eines Pfotenkneifreflexes.
4. Um die Sedierung aufrechtzuerhalten, verabreichen Sie bei Bedarf nach 50 Minuten eine weitere Anästhesiedosis (50% der Anfangsdosis).
5. Für eine zusätzliche topische Anästhesie tragen Sie einen Tropfen 0,5% Proxymetacain auf jedes Auge auf und blinzeln Sie überschüssige Flüssigkeit ab.
6. Zur Pupillenerweiterung tragen Sie einen Tropfen 0,5% Tropicamid auf jedes Auge auf und trocknen Sie dann überschüssige Flüssigkeit ab.

>4. Positionierung der ERG- und VEP-Elektroden

1. Platzieren Sie das Tier auf der ERG-Plattform vor der Ganzfeld-Schüssel, die sich im Faradayschen Käfig befindet. Vermeiden Sie die Verwendung eines elektrischen Heizkissens, da es elektrisches Rauschen in die elektrophysiologischen Aufzeichnungen einbringen kann.
   HINWEIS: Die Plattform ist an einer zirkulierenden beheizten Wasserplattform befestigt, um die Körpertemperatur zu halten.
2. Befestigen Sie das Tier mit einem Klettband auf der Plattform, der fest, aber nicht fest um den Nacken gelegt wird.
3. Haken Sie die inaktive VEP-Elektrode um die unteren Schneidezähne der narkotisierten Ratte ein.
4. Positionieren Sie die inaktiven ERG-Elektroden, indem Sie den Skleralring nicht-invasiv um den Äquator des Auges umschließen. Stabilisieren Sie diesen, indem Sie Elektroden an der Klettleiste um den Nacken anbringen. Wiederholen Sie dies für das kontralaterale Auge.
5. Befestigen Sie die aktiven VEP-Elektroden, indem Sie Krokodilklemmen an Edelstahlschrauben befestigen, die bereits am Schädel implantiert wurden.
6. Geben Sie einen kleinen Tropfen 1 % Carboxymethylcellulose-Natrium auf die Hornhaut, bevor Sie die aktive ERG-Elektrode platzieren, um die Signalqualität zu verbessern.
   HINWEIS: Die Viskoseflüssigkeit trägt auch dazu bei, die Hydratation der Hornhaut während des gesamten Experiments aufrechtzuerhalten, um die Bildung von Katarakt vom Austrocknungstyp bei Nagetieren zu minimieren.
7. Geben Sie einen kleinen Tropfen 1% Carboxymethylcellulose-Natrium auf die unteren Schneidezähne, um den Kontakt der inaktiven VEP-Elektrode und damit die Signalqualität zu verbessern.
8. Positionieren Sie die aktiven ERG-Elektroden so, dass sie die zentrale Hornhautoberfläche leicht berühren, indem Sie einen Mikromanipulator verwenden, der an einem speziell angefertigten stereotaktischen Arm befestigt ist.
9. Führen Sie 2 - 5 mm der geschliffenen Nadelelektrode (Edelstahl) subkutan in den Schwanz ein.
10. Trocknen Sie bei Bedarf überschüssige Flüssigkeit aus dem unteren Augenlid vor der Aufnahme, um die Signalqualität zu verbessern.
11. Schieben Sie die Plattform näher an die Ganzfeld-Schale heran und stellen Sie sicher, dass die Augen des Tieres mit der Öffnung der Schüssel ausgerichtet sind, um eine gleichmäßige Ausleuchtung beider Netzhäute zu ermöglichen (siehe Schritt 2.4.1).
12. Schließen Sie den Faradayschen Käfig, um Fremdgeräusche zu reduzieren.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Krokodilklemme	Generische Marke	HM3022	Edelstahl 26 mm Clip zum Anschluss von VEP-Schraubelektroden an Kabel
Bioverstärker	ADInstruments	ML 135	Zur Verstärkung von ERG- und VEP-Signalen
Carboxymethylcellulose Natrium 1,0%	Allergan	CAS 0009000-11-7	Viskose Flüssigkeit zur Verbesserung der Signalqualität der aktiven ERG-Elektrode
Carprofen 0,5%	Pfizer Animal Health Konzern	CAS 53716-49-7	Geschützter Name: Rimadyl injizierbar (50 mg/ml). Zur postoperativen Analgesie, verdünnt auf 0,5 % (5 mg/ml) in normaler Kochsalzlösung
Chlorhexadin 0,5%	Orion Laboratorien	27411, 80085	Zur Desinfektion von chirurgischen Instrumenten
Zirkulierendes Wasserbad	Lauda-Königshoffen	MGW Lauda	Zur Aufrechterhaltung der Körpertemperatur des anästhesierten Tieres während der Operation und elektrophysiologischen Aufzeichnungen
Zahn-Amalgam	DeguDent GmbH	64020024	Zum Ummanteln der Elektroden-Schädel-Anordnung, um sie robuster zu machen
Zahnfräser	Storz Instruments, Bausch und Lomb	#E0824A	Ein Miniatur-Bohrkopf mit ~0,7 mm Durchmesser, um ein kleines Loch in den Schädel über jeder Hemisphäre zu bohren, um VEP-Schrauben zu implantieren
Bohrer	Bosch	Dremel 300 Serie	Ein automatischer Bohrer zum Trepanieren
Elektrodenkabel	Gras Telefaktor	F-E2-30	Platinkabel zum Anschluss von Silberdrahtelektroden an den Verstärker
Faradayscher Käfig	maßgearbeitet		Gewährleistet Lichtbeständigkeit, um die Dunkelanpassung aufrechtzuerhalten. Umschließt das Ganzfeld-Setup, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu verbessern
Mulltupfer	Multigate Medical Products Pty Ltd	57-100 B.	Zum Trocknen des chirurgischen Schnitts und der freiliegenden Schädeloberfläche während der Operation
Ganzfelder Ulbrichtsche Kugel	Photometric Solutions International		Speziell entwickelter Lichtstimulator: 36 mm Durchmesser, 13 cm Öffnungsgröße
VELCRO	VELCRO Australien Pty Ltd	VELCRO Marke wiederverwendbare Hülle	Klettverschluss zur Befestigung der Elektroden und des Tieres auf der Aufnahmeplattform
Isofluran 99,9%	Abbott Australasia Pty Ltd	Artikel-Nr.: 26675-46-7	Geschützter Name: Isoflo(TM) Inhalationsanaästhetikum. Pharmazeutisches Inhalationsanästhetikum, gemischt mit Sauerstoffgas für die Chirurgie von VEP-Elektrodenimplantaten
Ketamin	Troy Laboratorien	Ilium Ketamil	Geschützter Name: Ketamil Injection, Marke: Ilium. Pharmazeutisches Anästhetikum für die elektrophysiologische Aufzeichnung
Luxeon-LEDs	Phillips Lighting Co.		Für die Lichtstimulation zwanzig 5 Watt und eine 1 Watt LEDs.
Mikromanipulator	Harvard-Apparatur	BS4 50-2625	Hält die aktive ERG-Elektrode während der Aufnahme
Nadel-Elektrode	Gras Telefaktor	F-E2-30	Subkutan in den Schwanz eingeführt, um als Masseelektrode sowohl für das ERG als auch für das VEP zu dienen
Phenylephrin 2,5% minims	Bausch und Lomb	CAS 61-76-7	Instilliert mit Tropicamid, um eine maximale Dilatation für ERG-Aufnahmen zu erreichen
Povidon-Jod 10%	Sanofi-Aventis	CAS 25655-41-8	Proprietärer Name: Betadine, Antiseptikum zur Vorbereitung der rasierten Haut auf die Operation 10%, 500 mL
Powerlab Datenerfassungssystem	ADInstruments	ML 785	Steuert die LEDs
Proxymetacain 0,5%	Alcon Laboratorien	CAS-Nr. 5875-06-9	Für die Hornhautanästhesie bei ERG-Aufzeichnungen
Kochsalzlösung	Gelflex		Nicht injizierbar, für die Galvanisierung von Silberdrahtelektroden
Geltungsbereich Software	ADInstruments	Version 3.7.6	Löst gleichzeitig den Stimulus über das Powerlab-System aus und sammelt Daten
Silber (feiner Runddraht)	A&E Metall	0,3 mm	Wird verwendet, um aktive und inaktive ERG-Elektroden und die inaktive VEP-Elektrode herzustellen
Rostfreie Streelschrauben	MicroFasterner		0,7 mm Schaftdurchmesser, 3 mm Länge, die über dem primären visuellen Kortex implantiert werden und als aktive VEP-Elektroden dienen
Stereotaktischer Rahmen	David Kopf	Modell 900	Ein stereotaktisches Instrument für Kleintiere zur Lokalisierung des primären visuellen Kortex gemäß Paxinos & Watsons 2007 Rattenhirn-Atlas-Koordinaten
Chirurgische Klinge	Swann-Morton GmbH	Nr. 206	Zum Einschneiden des Hautbereichs, der den primären visuellen Kortex überlagert, um die VEP-Elektroden zu implantieren
Naht	Verifizierter Lieferant - Shanghai Pudong Jinhuan Medizinische Produkte Co., Ltd		3-0 geflochtenes Seidennaht, nicht resorbierbar, für die Hautretraktion während der VEP-Elektrodenimplantation
Tobramycin-Augensalbe 0,3%	Alcon Laboratorien	CAS 32986-56-4	Geschützter Name: Tobrex. Prophylaktische antibiotische Salbe, die nach der Operation auf die Hautwunde aufgetragen
Tropicamid 0,5 %	Alcon Laboratorien	CAS 1508-75-4	Geschützter Name: 0,5 % Mydriacyl-Augentropfen, eingeträufelt, um Mydriasis für ERG-Aufzeichnungen zu erreichen
Xylazin	Troy Laboratorien	Ilium Xylazil-100	Pharmazeutisches Anästhetikum für die elektrophysiologische Aufzeichnung
Pipettenspitze	Eppendorf Pty Ltd	Tel.: 0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, für maßgefertigte Elektroden
Lethabarber Euthanazie Injektion	Virbac (Australien) Pty Ltd	LETHA450	325 mg/ml Pentobarbital-Natrium für eine schnelle Euthanasie
Microsoft Office Excel	Microsoft	Fassung 2010	Tabellenkalkulationssoftware für die Datenanalyse