A. mesenterica Kontraktion und Entspannung Studies Verwendung automatisierter Draht Myographie

Zusammenfassung

Eine automatisierte Myographie Methode zur Kraftmessung in isolierten mesenterialen Arterien beschrieben. Es beschäftigt Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myographions 510A, um Antworten auf Phenylephrin und extrazelluläres Calcium zu bestimmen. Die Methode ermöglicht eine konsistente Bestimmung der isometrischen Antworten auf Agonisten in kleinen Gefäßen mit einem Durchmesser von 60 bis 300 um, unabhängig.

Zusammenfassung

Proximal Widerstand Schiffe, wie die Arteria mesenterica, tragen wesentlich zu den peripheren Widerstand. Diese kleinen Schiffe zwischen 100-400 um Durchmesser Funktion in erster Linie bei der Leitung der Blutfluss zu den verschiedenen Organen nach den allgemeinen Vorschriften des Körpers. Die Ratte A. mesenterica hat einen Durchmesser von mehr als 100 um. Die Myographie Technik, die zuerst von Mulvay und Halpern ¹ beschrieben, wurde die Methode durch Bevan und Osher ² vorgeschlagen basiert. Die Technik bietet Informationen über kleine Gefäße unter isometrischen Bedingungen, in denen wesentliche Verkürzung der Muskel-Präparat wird verhindert. Da die Kraft der Produktion und der Empfindlichkeit der Gefäße auf verschiedene Agonisten ist abhängig vom Ausmaß der Dehnung, nach aktive Spannung Länge Zusammenhang ist es wichtig, zu einer Kontraktion Studien unter isometrischen Bedingungen durchzuführen, um die Einhaltung der Montage Drähte zu verhindern. Edelstahl Drähte sind mit Wolfram-Drähten aufgrund der Oxidation des letzteren, die aufgezeichneten Antworten ³ betrifft bevorzugt. Die Technik ermöglicht den Vergleich der Agonisten-induzierten Kontraktionen montiert Schiffe, Beweise für die normale Funktion der glatten Gefäßmuskelzellen Rezeptoren zu erhalten.

Wir haben in mehreren Studien gezeigt, dass isolierte mesenterialen Arterien, die mit phenylyephrine zusammengezogen sind bei der Zugabe von kumulativen Konzentrationen von extrazellulärem Calcium (Ca ^{2 +} _e) zu entspannen. Die Ergebnisse führten uns zu, dass perivaskulären sensorischen Nerven, die die G-Protein-gekoppelten Ca ^{2 +-Sensing-Rezeptor} (CAR) zum Ausdruck zu schließen, vermitteln diese Vasorelaxation Antwort. Mit einer automatisierten Draht Myographie Methode zeigen wir hier, dass Mesenterialarterien von Wistar, Dahl Salz-und Kleinschreibung (DS) und Dahl salzresistente (DR) Ratten reagieren unterschiedlich auf die Ca ^{2 +} _e. Gewebe von Wistar-Ratten zeigten höhere Ca ^{2 +-Sensitivität} im Vergleich zu denen von DR und DS. Reduzierte CaR Ausdruck in Mesenterialarterien von DS Ratten korreliert mit reduzierten Ca ^{2 +} _e-induzierte Relaxation von isolierten, pre-Vertrag Arterien. Die Daten deuten darauf hin, dass das Auto für Entspannung Mesenterialarterien unter erhöhtem adrenerge Ton erforderlich ist, wie es bei Bluthochdruck und zeigen einen angeborenen Defekt in der Car-Signalweg in Dahl Tiere, die viel schwerer in DS ist.

Die Methode ist hilfreich bei der Bestimmung Gefäßreaktivität ex vivo in mesenterialen Widerstand Arterien und ähnliche kleine Blutgefäße und Vergleiche zwischen verschiedenen Agonisten und / oder Antagonisten können einfach und konsistent bewertet werden Side-by-side ^6,7,8.

Protokoll

1. Isolierung von Ratten mesenterialen kleinen Arterie

1. Anesthetize Tier mit Isofluran in einer geschlossenen Kammer, und wischen Sie den Bauch mit Alkohol.
2. Führen Sie eine mid-line Laparotomie zu mesenterialen Bett aussetzen.
3. Mit einer Schere entfernen ca. 85 cm des Darms mit der Fütterung Gefäßsystem mit der A. mesenterica superior. Schneiden Sie das proximale Ende der Darmabschnitt in der Nähe des Pylorus und das distale Ende in der Nähe des ileo-coecal Kreuzung. Segmente des Darms von Ratten, die tief mit Isofluran und eingeschläfert durch offenen Brustkorb Herzpunktion isoliert sind.
4. Platziert herausgeschnitten Abschnitt in einer beschichteten Petrischale mit PSS und führen Sie die Dissektion der A. mesenterica bei Raumtemperatur.
5. Pin auf der proximalen Ende des Darms auf der rechten Seite und Stift heraus den Rest der intestineina Gegenuhrzeigersinn (ieproximal Ende auf der linken Fütterung Gefäßsystem auf der anderen Seite des Darms).
6. Dissect aus der Branche II und III Segmenten zusammen mit einem Stück des proximalen Segments.
7. Dissect aus der Vene und die Arterie zu isolieren (mit V-förmigen Verzweigung) und reinigen Sie sie durch das Entfernen der Fett-und Bindegewebe. Vermeiden Sie direkten Kontakt mit der Arterie, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette und Schneiden durch die Membran des Bindegewebes.

2. Montage des Schiffes

1. Schneiden Sie zwei kurze Abschnitte (≈ 4 cm) von einem 40 um Wolfram-freien Edelstahl-Draht, und mit einer feinen Pinzette, stecken Sie ein in das Lumen des jeweiligen Arterie dabei nicht an das Endothel beschädigt. Verwenden Sie die Drahtspitze zum Lumen öffnen, wenn notwendig. Blut strömte aus dem Behälter ist ein gutes Zeichen das Lumen ist eröffnet.
2. Füllen Sie den Myographions Kammer mit physiologischer Kochsalzlösung (PSS; mM: 115 NaCl, 4,7 KCl, 1,4 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 5 NaHCO _3, 1,2 K ₂ HPO _4, 1,1 Na ₂ HPO _4, 1,0 CaCl _2, 20 HEPES und 5 Glucose, pH 7,4) mit Ascorbinsäure (100 uM) bei 37 ° C und mit einer Pinzette vorsichtig übertragen threaded Gefäßsegment aus der Petrischale in die Kammer bei Raumtemperatur und übertragen Sie die herausgeschnittenen proximalen Gefäßabschnitt der Myographions Kammer und ziehen Sie den Ende entlang des Drahtes, um es in das Gefäß zu ernähren. Vermeiden Sie Strecken des Schiffes.
3. Sichern Sie das nahe Ende des Drahtes unter dem in der Nähe Befestigungsschraube auf der rechten Unterkiefer verbunden bis in den Mikrometerbereich gegen den Uhrzeigersinn. Fangen Sie das freie Ende des Drahtes mit einer Pinzette und sichern Sie es unter dem weit Befestigungsschraube auf der rechten Unterkiefer im Uhrzeigersinn. Stellen Sie sicher, dass das Schiff Segment entlang des Drahtes in die Lücke zwischen den Backen ist ohne jeden Kontakt mit dem Kiefer selbst entfernt.
4. Schrauben Sie die Kiefer auseinander und richten Sie den zweiten Draht parallel mit dem Schiff und setzen Sie sie in das Ende des Lumen. Vorsichtig den Draht durch das Lumen des Gefäßes Segment in einer Bewegung über die bereits montierte Kabel als Leitfaden. Halten Sie den Draht ca. 1 cm aus dem Behälter zu vermeiden, Stretching es während des Manövers, und berühren Sie das Endothel.
5. Schrauben Sie die Kiefer zusammen und gewährleisten, dass die zweite Montage Draht bewegt sich unterhalb des ersten auf der rechten Unterkiefer befestigt.
6. Sichern Sie das nahe Ende des zweiten Drahtes im Uhrzeigersinn unter dem in der Nähe Befestigungsschraube des linken Unterkiefers mit dem Wandler.
7. Sichern Sie das andere Ende des Drahtes unter die Befestigungsschraube auf der linken Backe, und ziehen Sie den Draht zu strecken.
8. Nach Montage abgeschlossen ist, setzen Sie den Motor in der "Montage-Menü" und starten Sie die Normalisierung des Schiffes.

3. Normalisierung

Das Auto Dual Wire Myographions System-510A verfügt über eine automatische Normalisierung Funktion, die von der "Normalisierung" Menü beurteilt wird und ermöglicht das Schiff zu einem normalisierten Innenumfang nach einem standardisierten Verfahren werden nach dem Protokoll des Herstellers gestreckt nach Äquilibrierung für 30 min bei 37 ° C. Eine exponentielle Kurve wird dann an den Innenumfang Druckdaten ausgestattet. Das Verfahren legt die Lumendurchmesser (d 100), dass die Arterie würde in vivo gehabt haben, wenn entspannt und unter einem transmuralen Druck von 100 mmHg ¹ Die Normalisierung Parameter für Ratten A. mesenterica sind wie folgt.:

1. Ziel transmuralen Druck = 13,3 kPa (100 mm Hg).
2. Time = 60 sec, Dauer der einzelnen Schritte der Normalisierung.
3. IC ₁ / IC ₁₀₀ = 0,9 (IC ₁ = normalisierte Innenumfang, IC ₁₀₀ = Innenumfang entsprechende Soll-Druck.
4. Okular-Kalibrierung 2 * Δ (mm / Okular Division), 2-Delta ist für die Programmierung von Gründen.

Messen Sie die Länge der montierten Mesenterialarterie unter dem Mikroskop Okular Lesungen, wenn die Haarlinien über die Nähe und Ferne Enden der montierten Behälter Segm sindENT. Kurz gesagt, ist die Länge der montierten Gefäßsegment bei maximaler Vergrößerung mit einem geeichten Okular Okular in den Dissektionsmikroskop gemessen. Das Okular Lesung mit Haar-line über das Ende des Segments (a ₁₎ und das nahe Ende des Segments (a ₂₎ in okulären Divisionen sind gemessen und aufgezeichnet. Diese Werte, mit der Mikrometer-Lesungen, werden vor und nach dem Dehnen des Schiffes erfasst und in den Menüs für das Programm, um die angepasste Kurve und der Innendurchmesser entsprechend dem Ziel transmuralen Druck von 100 mm Hg berechnet

In unseren Untersuchungen wurden die Arterien mit dem Lumen Durchmesser d ₁ Satz = 0,9 xd _100, wo aktive Kraftentwicklung maximal ist. Aktive Kraft Entwicklung von ≥ 10 mN in Ratte Mesenterialarterien wird als optimal für Experimente, um fortzufahren. Gewebe mit niedriger aktive Kraft, wurden verworfen.

4. Messung von Reaktionen

Nach der Normalisierung sind die mechanischen und funktionellen Eigenschaften der Gefäße, indem Sie eine "Standard-start", die anspruchsvolle Schiffe umfasst mit wiederholten Anwendungen (in der Regel 2 oder 3) von 5 uM Phenylephrin (PE), um reproduzierbare Kontraktionen erhalten wieder aktiviert. Ein typischer "standard start" in unserem Labor besteht aus einer Reihe von Reizen und Auswaschung Perioden wie folgt:

1. Ersetzen Myographions Kammerdeckel und starten Belüftung mit 95% Luft und 5% CO _2.
2. Kammer füllen mit frischem PSS (mit 100 uM Ascorbinsäure)
3. Contract Schiff mit 5 uM PE für 5 min und 4 x waschen mit PSS-Puffer.
4. Nach der letzten Waschung, Nachfüll-Kammer mit PSS und warten Sie 3 Minuten vor dem Wiederholen der Schritte (ii) und (iii).

Nach der Standard-Start wird die Arterie bereit für das Experiment. Eine Lockerung der kontrahierten Schiffe werden durch kumulative Zugabe von steigenden Konzentrationen von CaCl ₂ (- 4 mM 0,5) bewertet. Als Inhibitoren werden verwendet, Schiffe werden mit den Verbindungen in die Myographions Kammer für 20 min und präsentieren während des Assays vorinkubiert.

5. Data Analysis

Die "Normalisierung" Daten für Schiffe und Kraft Kurven direkt in Text umgewandelt, wurden mit dem SigmaPlot 11,0 Grafik-Programm (Systat Software, Point Richmond, CA) analysiert und dargestellt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Konzentrations-Wirkungs-Daten aus den Kurven berechnet wurden durch die Bestimmung EC _50-Werte aus den experimentellen Daten angepasst, um ein Vier-Parameter logistische Funktion in der Pharmakologie-Menü des Programms analysiert. Vergleiche zwischen den Gruppen und innerhalb der Gruppen wurden von One Way Analysis of Variance (ANOVA) und Unterschiede mit p <0,05 werden als signifikant durchgeführt.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Parameters	Wistar	Dahl Salz-Sensitive	Dahl Salz-Resistant
L 100 (um)	83,26 ± 2,33	91,52 ± 4,67	117,45 ± 8,43 *
X 1	604,21 ± 41,97	752,24 ± 85,25	745,84 ± 110,09
r 2	0,99 ± 0,003	0,97 ± 0,008	0,97 ± 0,007

* Der Unterschied zwischen L ₁₀₀ Werte für Wistar und DR sind statistisch signifikant. Shapiro-Wilk Test auf Normalverteilung bestanden (p = 0,588); gleiche Varianz Test bestanden (p = 0,237).

L ₁₀₀ = Innendurchmesser des montierten Segment entsprechend dem angestrebten transmuralen Druck.

X ₁ = Die Mikro-Stellungsregler Einstellung erforderlich, um die Montage Schiffes, seine normalisiert Innenumfang (dh der Wert der Mikrometer-Lesung in denen Versuche durchgeführt wurden) zu dehnen.

r ² = Regressionskoeffizient für Sitz (X _i, Y _i) zu einer exponentiellen Kurve.

NB: Die genaue Vorgehensweise ist im Handbuch für den 510A Myographions System ⁶ beschrieben.

Tabelle 1. Beispiel Read-Out der Normalisierung Parameter für Mesenterialarterie Segmente aus Wistar, DS und DZ ab Basic-Programm in der "Normalisierung Menu" gezeigt. Die Werte sind Mittelwerte (± SEM) von 5 Tieren. * Die Unterschiede zwischen L ₁₀₀ Werte für Wistar und DS sind statistisch signifikant (p <0,05).

Wistar	DS	DR
14,2 ± 0,6		20,9 ± 1,3 *

Tabelle 2. Entwickelt Spannungen (mN) in mesenterialen Arterien von Wistar, DS-und DR-Ratten isoliert, folgende Anwendungen von 5 uM PE in jedes Gefäß. Angegebenen Werte sind Mittel (± SEM) von 6-8 Tieren. * Signifikant verschieden von Wistar Kontrollen (p <0,05).

Abbildung 1. Ca ^{2 +} _e-induzierte Relaxation von PE-Vertrag A. mesenterica aus einer Wistar-Ratte montiert in einem Draht Myographions in physiologischer Kochsalzlösung mit 1 mM Ca ^{2 +.} Die Arterie wurde equilibriert für 30 min bei 37 ° C mit konstanter Belüftung und Antworten auf Ca ^{2 +} _e bestimmt. Eine repräsentative Kraft Tracing bei Zugabe von 5 uM PE durch kumulative Zugabe von Ca ^{2 +} gefolgt wird angezeigt.

Abbildung 2. Ca ^{2 +} _e-induzierte Relaxation von PE-Vertrag A. mesenterica aus einer DS Ratte montiert in einem Draht Myographions in physiologischer Kochsalzlösung mit 1 mM Ca ^{2 +.} Die Arterie wurde equilibriert für 30 min bei 37 ° C mit konstanter Belüftung und Antworten auf Ca ^{2 +} _e bestimmt. Eine repräsentative Kraft Tracing bei Zugabe von 5 uM PE durch kumulative Zugabe von Ca ^{2 +} gefolgt wird angezeigt. Ca ^{2 +} Entspannung war schwer in diesem Gewebe im Vergleich zu denen von Wistar-und DR-Ratten beeinträchtigt.

Abbildung 3. Ca ^{2 +} _e-induzierte Relaxation von PE-Vertrag A. mesenterica aus einer DR Ratte montiert in einem Draht Myographions in physiologischer Kochsalzlösung mit 1 mM Ca ^{2 +.} Die Arterie wurde equilibriert für 30 min bei 37 ° C mit konstanter Belüftung und Antworten auf Ca ^{2 +} _e determined.A Vertreter Kraft Tracing bei Zugabe von 5 uM PE durch kumulative Zugabe von Ca ^{2 +} gefolgt wird angezeigt.

Abbildung 4. A. [Ca ^{2 +]} _{e-Wirkungs-Kurven.} B. Balkendiagramm mit EC _50-Werte für Entspannung durch Anpassen der Daten an ein Vier-Parameter logistische curve.C.CaR Ausdruck in mesenterialen Arkaden von DR und DS Ratten isoliert bestimmt.

Diskussion

Bluthochdruck ist eine der Hauptursachen für Herz-Kreislauf-, Hirn-und renale Morbidität / Mortalität. Das Auftreten von Bluthochdruck ist hoch in der Bevölkerung und Salz-sensitive Bluthochdruck ist besonders hoch in der Alterung der Bevölkerung, und häufiger in Schwarze als Weiße. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen sein, die Tendenz der Schwarzen zu Natrium in den Nieren ⁹ behalten. Salz-Sensitivität ist ein wesentlicher Faktor für Nierenerkrankungen und ist mit einer endothelialen Dysfunktion assozi...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Gerätes / Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Auto Dual Wire Myographions System-510A DMT-USA, Inc.	Atlanta, GA.	100151
PowerLab/4SP Data Acquisition System	ADInstruments, Colorado Springs, CO	ML750	Neue Modelle mit 4-16 Eingangskanäle zur Verfügung.
Dell Dimension XPS Gen 4 Computer	Dell
Stemi SV II (Apo) Präparation Mikroskop mit Ocular	Carl Zeiss International.
Wistar, Dahl Salz-und Kleinschreibung, Dahl Salz-resistenten Ratten	Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN.
Rodent Chow	Harland Tekland, Madison, WI.
Phenylephrin	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO.
Andere Chemikalien			Alle verwendeten Chemikalien wurden von den reinsten Sorten im Handel erhältlich.