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>1. Einrichten des Puff-Pipettengeräts
HINWEIS: Es gibt fünf grundlegende Komponenten für diesen Aufbau: die Glaspipette, den Schlauch, die Spritze, den Mikromanipulator und den Puffer (Hank's) Tabelle 1. Jeder Puffer, der physiologisch relevante Salzkonzentrationen aufweist, könnte in diesem Aufbau verwendet werden.
- Eine Borosilikatpipette wird mit einem Mikropipettenabzieher und den in Tabelle 2.
beschriebenen Spezifikationen mit einer Öffnungsspitze von etwa 45 μm gezogen
HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass 45 μm unter experimentellen Bedingungen eine geeignete Größe für den Durchmesser der Pipettenöffnung ist. Geringfügige Abweichungen in der Öffnungsgröße sollten das Ergebnis nicht wesentlich beeinflussen. Es ist wichtig zu beachten, dass größere Abweichungen von dieser Zahl immer noch für die Varizeninduktion funktionieren sollten, indem die Höhe der Spritze, die über einen Schlauch mit der Pipette verbunden ist, angepasst wird, dies erfordert jedoch eine Neukalibrierung des Druckwerts.
- Führen Sie das nicht gezogene Ende der Pipette in einen dünnen Gummischlauch ein.
Anmerkung: Die Schlauchwand sollte dünn und steif sein, um den Flüssigkeitswiderstand zu minimieren und sicherzustellen, dass die Höhe der Spritze direkt proportional zum Druck der Flüssigkeit ist, die mit vernachlässigbarem Widerstand durch die Pipette fließt. Der Schlauch sollte nicht länger als ca. 0,6 m sein, um den Widerstand weiter zu minimieren.
- Verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs über einen Anschluss mit einem drehbaren Ventil mit einer 10-ml-Kunststoffspritze.
Anmerkung: Die Kunststoffspritze muss in einer konstanten, messbaren Höhe gehalten werden, um eine genaue Messung des angenommenen Drucks zu gewährleisten, der von der Pipette ausgeht. Es wurde eine Höhe von 190 mm verwendet, da dies einen minimalen Druck erzeugt, aber zuverlässig Varizen in den Axonen induziert. Es können auch andere Höhenwerte verwendet werden, wenn sich die Zellen durch den Druck von der Deckglasoberfläche lösen. Es wird empfohlen, während des gesamten Experiments die gleiche Einstellung zu verwenden.
- Führen Sie die Pipette in den Schraubverschluss des Mikromanipulators ein, um die Pipette an Ort und Stelle zu halten. Schrauben Sie die Metallschraube mit flacher Spitze, die am Mikromanipulatorarm befestigt ist, so fest, dass sie das nicht gezogene Ende der Pipette knapp über der Stelle hält, an der der Gummischlauch befestigt ist. Winkeln Sie die Pipette in einem Winkel von 45° zur Oberfläche der neuronenhaltigen Deckgläser an. HINWEIS: Der Mikromanipulator sollte so konstruiert sein, dass die Pipette gehalten werden kann, ohne den Gummischlauch einzuengen. Der Mikromanipulator muss eine Bewegung der Pipette in x-, y- und z-Richtung zulassen, um sie genau im Bereich der Zellen zu positionieren. Eine Grafik und ein Foto des Geräts sind unten aufgeführt (Abbildung 1).
- Schalten Sie einen Fluoreszenzfilter ein, öffnen Sie die Blende und stellen Sie sicher, dass ein Fluoreszenzfleck durch das Objektiv fällt. Bewegen Sie die Pipette mit dem Mikromanipulator in eine Position, die die Spitze mit dem Fluoreszenzfleck ausrichtet, und senken Sie die Pipette in eine Position knapp über der Höhe der Zellkulturschale (35 mm x 10 mm). Sobald es in Position ist, schalten Sie das Durchlicht ein und schalten Sie die Fluoreszenz aus.
- Geben Sie mit einer Pinzette ein Deckglas (mit den Zellen nach oben zur Pipette hin) von der Zellkulturplatte in die Zellkulturschale mit etwa 2 ml Hank-Puffer bei Raumtemperatur.
- Setzen Sie die Kulturschale mit dem Deckglas auf das Zielfernrohr.
- Fokussieren Sie mit dem Feinfokusknopf und dem 20-fach-Objektiv auf eine Ebene, die sich etwa vier volle Umdrehungen über den Zellen befindet (ca. 0,4 mm). Positionieren Sie die Pipettenspitze mit dem Mikromanipulator so, dass sie fokussiert ist und sich in der Mitte der linken Seite der Ebene befindet, wie sie durch die Okulare gesehen wird.
Anmerkung: Dendriten sind Projektionen, die sich im selben Rahmen befinden sollten wie der Zellkörper, aus dem sie stammen. Um axonale Varikositäten zu induzieren, sollte man längeren Projektionen vom Zellkörper zu medialen und distalen Axonen folgen.
>2. Kalibrieren des Drucks der Pipette mit Hilfe eines dehnbaren Membransystems
- Richten Sie die Puffpipettenapparatur mit genau den gleichen Parametern wie oben beschrieben über einem System ein, das eine mikrofabrizierte Silikonmembran (500 μm Durchmesser und 50 μm Dicke) enthält, und fokussieren Sie das Mikroskop auf die Oberfläche der Membran.
Anmerkung: Dieses System wurde entwickelt, um kleine Druckwerte zu messen, und eine Erklärung des Systems wurde bereits veröffentlicht. Diese Messung muss für Puff-Experimente nur einmal durchgeführt werden, wenn genau die gleiche Einstellung für das Puffen verwendet wird.
- Fokussieren Sie das Mikroskop auf die Arrays von Mikropunkten (4 μm Durchmesser und 10 μm Abstand, gemessen zwischen den Zentren). Drehen Sie das Absperrventil und lassen Sie die Flüssigkeit aus der Pipette fließen. Untersuchen Sie die Ablenkung der Membran als Reaktion auf den Flüssigkeitsdruck mit einem konfokalen Mikroskop.
- Verwenden Sie ein lineares Modell, um den entsprechenden Druck zu bestimmen, der mit der Ablenkung der Membran verbunden ist.
Anmerkung: Während eine kürzlich durchgeführte Studie ergab, dass eine Ablenkung von w = -3,143 ± 0,69 μm für eine Spritzenhöhe von 190 mm erzielt wurde, ergab dies einen Druck von 0,25 ± 0,06 nN/μm 2 aus dem aktuellen Pipettenaufbau, der im physiologischen und pathologischen Bereich liegt, obwohl die Spritzenhöhe nicht die einzige Determinante ist. Auch andere Faktoren beeinflussen den genauen Druckwert auf die Neuronen, darunter die Pipettenöffnung, die Positionierung (Abstand und Winkel) der Pipettenspitze relativ zu den Zellen und sogar die Flexibilität des Schlauchs.
>3. Puffen, um Krampfadern auszulösen
- Sobald die Pipette in Position ist, fokussieren Sie das Mikroskop auf eine Ebene, die einen interessierenden Bereich enthält. Positionieren Sie die Zellen und Prozesse in der linken Hälfte des Bildfeldes (sichtbar durch die Live-Aufnahme der Kamera) innerhalb des Puffing-Bereichs, während sich die rechte Hälfte außerhalb des Puffing-Bereichs befindet.
Anmerkung: Aufgrund des ausgedehnten Auswachsens von Axonen und Dendriten von Neuronen ist es unwahrscheinlich, dass sich alle Fortsätze eines Neurons im selben Aufblähungsbereich befinden. Dies ist eigentlich ein Vorteil dieses Systems, das es ermöglicht, die lokale Wirkung des Puffens zu untersuchen. Es gibt zwei Arten von Puffing, die verwendet werden können, um Krampfadern zu induzieren: langanhaltendes Puffen und Pulspuffen.
- Aufblähung
- Langes Puffen
- Positionieren Sie die Spritze in einer Höhe von 190 mm über dem Deckglas, das die kultivierten Neuronen enthält. Beginnen Sie mit der Zeitraffer-Bildgebung des interessierenden Bereichs mit einer optimierten Belichtungszeit, die eine klare neuronale Morphologie zeigt. Erfassen Sie mindestens 15 Frames in einem Intervall von 2 s (insgesamt 30 s) als Basislinie. Das Intervall kann je nach Experiment angepasst werden. Öffnen Sie bei Frame 16 das drehbare Absperrventil der Spritze und lassen Sie die Flüssigkeit 75 Frames (150 s) lang fließen. Drehen Sie das Ventil bei Rahmen 75 ab, so dass der Flüssigkeitsfluss stoppt. Video Capture stoppen.
HINWEIS: Dies sollte axonale Varikositäten in Neuronen 7-9 DIV innerhalb von 5-10 s induzieren, während ältere Neuronen länger brauchen, um Varikositäten zu bilden.
- Puls (2 s Dauer) Schnaufen
- Positionieren Sie die Spritze in der richtigen Höhe (190 mm). Beginnen Sie mit der Zeitrafferaufnahme und nehmen Sie mindestens 15 Bilder (30 s) in einem Intervall von 2 s auf. Öffnen Sie am Rahmen 16 das Ventil der Spritze und lassen Sie die Flüssigkeit fließen, dann schließen Sie das Ventil nach 2 s. Warten Sie 5-20 s (abhängig von der zu testenden Frequenz), bevor Sie das Ventil wieder öffnen. Wiederholen Sie das Öffnen und Schließen des Ventils, um Flüssigkeitsimpulse zu erzeugen, und fahren Sie für einen Gesamtzeitraum von 150-300 s fort. Setzen Sie die Zeitraffer-Bildgebung 20 Minuten lang fort, um die Erholungsphase zu erfassen.
Anmerkung: Wenn das Intervall länger als 10 s ist, induzieren die Impulse drastisch weniger Krampfadern. Im Abstand von 20 s können keine Krampfadern mehr durch die Impulse induziert werden. Um eine zuverlässige, gleichmäßige Krampfaderbildung zu erhalten, wird empfohlen, dass die Spritzenhöhe etwa 190 mm betragen sollte. Die Spritzenhöhe und der Flüssigkeitsdruck sollten nicht so weit angehoben werden, dass sich die Zellen von der Deckglasoberfläche lösen.
- Reinigen Sie vor einem Tag der Anwendung das Setup (Pipette, Schlauch und Spritze), indem Sie etwa 10 mL 70% Ethanol durch das Setup fließen. Lassen Sie nach der Ethanolwäsche 10 ml Hanks Puffer (oder den gewünschten Puffer) durch die Einrichtung, um das System für den Einsatz an diesem Tag vorzubereiten. Reinigen Sie den Aufbau nach Beendigung der Experimente für den Tag wie zuvor beschrieben mit Ethanol, um das Wachstum von Verunreinigungen über Nacht zu verhindern.
Tabelle 1: Hanks Pufferrezept. Dieses Rezept bereitet den Puffer vor, der im Puffing-Protokoll und bei der Bildgebung lebender Zellen verwendet wird.
| Hank's Puffer (Filter, pH = 7,4, bei 4 °C lagern) |
| ca. 150 mM | NaCl |
| ca. 4 mM | Kcl |
| ca. 1,2 Mio. | MgCl2 |
| 1 mM | CaCl2 |
| 10 mg/ml | D-Glukose |
| ca. 20 mM | HEPES |
Tabelle 2: Parameter für das Pipettenziehen. Stellt die Parameter bereit, die am Pipettenabzieher eingestellt werden müssen, um eine Öffnung mit einem Durchmesser von etwa 45 μm zu erhalten.
kg
| Parameter für das Pipettenziehen |
| Wärme | ziehen | Geschwindigkeit | Verzögerung | Druck | Rampe |
| Nr. 501 | 0 | Nr. 15 | 1 | 500 | 530 |
