$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
>1. Stereotaktische Injektion von Mesh-Elektronik in lebende Mäusegehirne
HINWEIS: Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion mit einer Mischung aus 75 mg/kg Ketamin und 1 mg/kg Dexdomitor anästhesiert. Der Grad der Anästhesie wurde vor Beginn der Operation mit der Toe-Pinch-Methode überprüft. Die Körpertemperatur wurde aufrechterhalten, indem die Maus unter Narkose auf eine 37 °C warme homöotherme Decke gelegt wurde. Für die Operation wurde eine geeignete sterile Technik implementiert, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Autoklavieren aller chirurgischen Metallinstrumente für 1 Stunde vor dem Gebrauch, die Verwendung sterilisierter Handschuhe, die Verwendung eines Heißperlensterilisators während der gesamten Operation, die Aufrechterhaltung eines sterilen Feldes um die Operationsstelle, die Desinfektion von Kunststoffinstrumenten mit 70% Ethanol und die Vorbereitung der enthaarten Kopfhaut mit Jodophor vor dem Einschnitt. Für Überlebensoperationen wurde nach Abschluss der Operation eine antibiotische Salbe um die Wunde aufgetragen und die Maus in einen Käfig zurückgebracht, der mit einem 37 °C warmen Heizkissen ausgestattet war. Die Mäuse wurden nicht unbeaufsichtigt gelassen, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt hatten, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Die Mäuse erhielten eine Buprenorphin-Analgesie durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis von 0,05 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden für bis zu 72 Stunden nach der Operation. Mäuse wurden nach der Operation von anderen Tieren isoliert. Die Mäuse wurden entweder durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital in einer Dosis von 270 mg/kg Körpergewicht oder durch transkardiale Perfusion euthanasiert.
- Betäuben Sie die Maus und fixieren Sie sie in einem stereotaktischen Rahmen.
- Tragen Sie Augengleitmittel auf die Augen der Maus auf, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Verwenden Sie einen Zahnbohrer und einen stereotaktischen Rahmen, um eine Kraniotomie an den gewünschten Koordinaten am Schädel zu eröffnen. Öffnen Sie eine zweite Kraniotomie außerhalb der Injektionsstelle, um eine Erdungsschraube oder einen Erdungsdraht aus Edelstahl einzuführen.
- Befestigen Sie einen Klemmuntergrund mit Zahnzement am Schädel. Schneiden Sie einen ca. 1 mm breiten Spalt in das Substrat, um die Zuverlässigkeit des Faltschritts im späteren Verlauf des Verfahrens zu verbessern.
Anmerkung: Ein flaches flexibles Kabel (FFC), das auf eine "L"-Form geschnitten ist, funktioniert gut (Abbildung 4A), obwohl viele Materialien funktionieren würden, solange sie die richtige Dicke für den 32-Kanal-ZIF-Steckverbinder (Zero Insertion Force) haben (ausgelegt für 0,18 ± 0,05 mm dicke Kabel).
- Montieren Sie den Pipettenhalter mit der Nadel mit der Netzelektronik mit einer rechtwinkligen Endklemme auf den stereotaktischen Rahmen (Abbildung 2C und Abbildung 3A).
- Befestigen Sie den seitlichen Auslass des Pipettenhalters mit einem ca. 0,5 bis 1 m langen Kapillarschlauch an einer 5-ml-Spritze, die in einer Spritzenpumpe befestigt ist (Abbildung 3D).
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Kapillarschlauch befinden, bevor Sie ihn an den Pipettenhalter anschließen. Blasen können den Fluss während der Injektion unterbrechen und eine reibungslose, kontrollierte Abgabe der Mesh-Elektronik verhindern.
- Positionieren Sie die Nadelspitze mit dem stereotaktischen Rahmen an der gewünschten Startstelle im Gehirn.
Anmerkung: Die hier verwendeten Netzelektronik-Sonden sind mit Aufzeichnungselektroden ausgelegt, die über eine Länge von ca. 2 mm verteilt sind, und wobei sich die erste Elektrode ca. 0,5 mm von der Anfangskante der Netzelektronik entfernt befindet (äußerste linke Kante in Abbildung 1A). Aus diesem Grund sollten die stereotaktischen Koordinaten so gewählt werden, dass der Startort 0,5 mm tiefer liegt als die interessierende Hirnregion. Die Ausbreitung und Position der Aufzeichnungselektroden innerhalb der Netzelektronik kann während des Maskendesignprozesses frei gewählt werden und sollte so gewählt werden, dass die Aufzeichnungselektroden die interessierende(n) Gehirnregion(en) überspannen, während sie entlang ihrer stereotaktischen Flugbahn injiziert werden.
- Positionieren Sie die Kamera (Abbildung 3B) so, dass die Oberseite der Netzelektroniksonde in der Glasnadel angezeigt wird. Einige Software ermöglicht es dem Benutzer, eine Linie auf dem Bildschirm zu zeichnen, um die ursprüngliche Position der Mesh-Elektronik zu markieren.
- Starten Sie den Durchfluss, indem Sie die Spritzenpumpe auf eine niedrige Drehzahl einstellen und auf Start drücken. 10 mL/h ist eine typische Startflussrate für eine Kapillarnadel mit einem Innendurchmesser von 400 μm. Erhöhen Sie langsam die Durchflussrate, wenn sich die Maschenelektroniksonde nicht innerhalb der Nadel bewegt.
Anmerkung: Es ist wichtig, das Volumen der in das Gehirn injizierten Flüssigkeit zu minimieren, da dies das Gewebe um die Injektionsstelle herum schädigen kann. Die besten Ergebnisse werden mit einem Injektionsvolumen von weniger als 25 μl pro 1 mm injizierter Maschenweite erzielt. Idealwerte liegen bei weniger als der Hälfte dieses Volumens; In unserem Labor injizieren wir in der Regel 10–50 μl pro 4 mm injizierter Maschenweite.
- Wenn sich die Netzelektroniksonde innerhalb der Nadel zu bewegen beginnt, ziehen Sie die Nadel mit dem stereotaktischen Rahmen mit der gleichen Geschwindigkeit zurück, mit der die Netzelektroniksonde injiziert wird, wobei Sie sich an der markierten ursprünglichen Position der Netzelektronik orientieren können.
Anmerkung: Dieses Verfahren, das als Sichtfeld-Injektionsmethode (FoV) bezeichnet wird, ermöglicht eine präzise Abgabe von Mesh-Elektronik an eine Zielregion des Gehirns, ohne zu zerknittern oder zu verrenken. Oft kann die Durchflussrate reduziert werden, sobald sich die Maschenelektroniksonde in der Nadel zu bewegen beginnt. In unserem Labor sind häufig Flussraten von 20–30 mL/h erforderlich, um die Haftreibung zwischen dem Netz und den Kapillarnadelwänden zu überwinden, aber die Rate kann dann auf 10 mL/h reduziert werden, sobald der Injektionsprozess eingeleitet wurde. Die Flussraten und das Injektionsvolumen sind bei Kapillarnadeln mit kleinerem Durchmesser in der Regel kleiner.
- Lassen Sie die Kochsalzlösung weiter fließen und ziehen Sie die Nadel zurück, bis die Nadel aus dem Schädel ausgetreten ist. Stoppen Sie den Durchfluss aus der Spritzenpumpe.
>2. Ein-/Ausgabe-Schnittstelle
HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt wurde die Mesh-Elektroniksonde vom gewünschten Startpunkt innerhalb des Gehirns entlang der gewählten Bahn injiziert. Die Nadel wurde zurückgezogen und befindet sich direkt über der Kraniotomie, wobei sich die Netzelektronik vom Gehirn zur Nadel erstreckt und die Ein-/Ausgabe-Pads (I/O) sich noch in der Nadel befinden (Abbildung 4B). In diesem Abschnitt wird eine Leiterplatte (PCB; Abbildung 4, Abbildung 5) zur Schnittstelle mit der Netzelektroniksonde. Die Leiterplatte verbindet einen ZIF-Steckverbinder mit einem 32-Kanal-Standardverstärkerstecker durch ein isolierendes Substrat, das zur Hauptstufe für neuronale Aufzeichnungsexperimente wird. Die Leiterplatte ist anpassbar, um verschiedene Kopfstufenkonfigurationen aufzunehmen. Unsere Designdateien sind auf Anfrage oder über die Ressourcen-Website meshelectronics.org erhältlich und können verwendet werden, um Leiterplatten kostengünstig von Anbietern von Leiterplattenherstellungs- und Montagedienstleistungen zu kaufen.
- Verwenden Sie den stereotaktischen Rahmen, um die Nadel vorsichtig zum FFC-Klemmsubstrat und über den Spalt zu führen, und lassen Sie die Lösung mit der Spritzenpumpe fließen, um ein Spiel in den Mesh-Elektronikverbindungen zu erzeugen (Abbildung 4C).
- Sobald sich die Nadel über dem Klemmsubstrat und über dem Spalt befindet, setzen Sie den Fluss mit hoher Geschwindigkeit fort, um die E/A-Pads der Netzelektronik auf das Klemmsubstrat auszuwerfen (Abbildung 4D).
- Biegen Sie die I/O-Pads mit einer Pinzette und einer Pipette aus deionisiertem Wasser (DI) in einem Winkel von ca. 90° so nah wie möglich an das erste I/O-Pad.
Anmerkung: Das Biegen ist notwendig, damit die Pads in einem nachfolgenden Schritt in den ZIF-Steckverbinder auf einer Leiterplatte eingelegt werden können. Der ZIF-Steckverbinder hat genau die gleiche Breite wie die 32 I/O-Pads der Mesh-Elektroniksonde, so dass eine unvollkommene 90°-Biegung oder eine Biegung, die nicht direkt vor dem ersten I/O-Pad auftritt, dazu führt, dass die I/O-Pads abgeschnitten werden müssen (die Pads ganz links in Abbildung 4E).
- Sobald die I/O-Pads ausgerichtet, entfaltet und in einem 90°-Winkel zum Mesh-Schaft stehen, trocknen Sie sie an Ort und Stelle mit sanft strömender Druckluft.
Anmerkung: Mesh-Elektroniksonden mit weniger als 32 Kanälen können mit derselben 32-Kanal-Schnittstellenkarte verbunden werden. In unserem Labor werden beispielsweise häufig 16-Kanal-Mesh-Elektroniksonden mit 32-Kanal-Leiterplatten verwendet. Dies bietet zusätzlichen Platz innerhalb des ZIF-Steckers, was die Schnittstelle erleichtert, und die zusätzlichen unkontaktierten Kanäle können durch Impedanztests während der Aufnahmesitzungen leicht als offene Stromkreise identifiziert werden.
- Schneiden Sie das Klemmsubstrat an einer geraden Kante ca. 0,5 bis 1 mm von der Kante der E/A-Pads ab. Schneiden Sie auch Fremdteile des Klemmsubstrats ab, die das Einstecken in den auf der Leiterplatte montierten 32-Kanal-ZIF-Steckverbinder behindern (Abbildung 4F).
- Stecken Sie die E/A-Pads in den ZIF-Anschluss auf der Leiterplatte, und schließen Sie die Verriegelung (Abbildung 4G). Verwenden Sie die Messelektronik, um die Impedanz zwischen den Kanälen und der Schraube zu messen, um eine erfolgreiche Schnittstelle zu bestätigen. Wenn die Impedanzwerte zu hoch sind, lösen Sie den ZIF-Stecker, passen Sie den Einsteckvorgang an und wiederholen Sie den Test, bis die erfolgreiche Verbindung bestätigt wurde.
- Decken Sie den ZIF-Stecker und die freiliegenden Mesh-Elektronikverbindungen zum Schutz mit Zahnzement ab. Drehen Sie die Leiterplatte an der Lücke im Substrat um und befestigen Sie die Leiterplatte mit Zement auf dem Schädel der Maus (Abbildung 4H).
Anmerkung: Das Biegen des FFC am Spalt reduziert die mechanische Belastung, die manchmal die Mesh-Elektronikverbindungen brechen kann.
- Lassen Sie den Zement aushärten und verwandeln Sie die Leiterplatte in einen robusten, kompakten Kopftisch, der bei nachfolgenden Aufnahmesitzungen als Schnittstelle verwendet werden kann (Abbildung 4I).
>3. Experimente zur neuronalen Aufzeichnung
- Platzieren Sie die Maus in einem Schwanzveiner oder einem anderen Rückhaltesystem. Stecken Sie die Vorverstärkerplatine in den Standardverstärkeranschluss auf der Kopftischplatine. Verwenden Sie ein separates Kabel, um die Referenzschraube zu erden.
- Lassen Sie die Maus für zurückhaltende Aufnahmen in der Zurückhaltung. Erfassen Sie die Daten mit dem Datenerfassungssystem für den gewünschten Zeitraum (Abbildung 5A).
- Für frei bewegliche Aufnahmen lösen Sie die Maus aus dem Halterung, nachdem Sie die Vorverstärkerplatine eingesetzt und die Referenzschraube geerdet haben. Aufzeichnung für die gewünschte Zeitdauer mit dem Datenerfassungssystem, während sich die Maus frei verhält (Abbildung 5B)
