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Alle Verfahren mit Tiermodellen wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.
>1. Lösungen
- Lösung zum Schneiden
- Die Zusammensetzung der Schneidelösung finden Sie in Tabelle 1.
- Bereiten Sie im Voraus eine 20-fache Stammlösung vor und lagern Sie diese bis zu 1 Monat bei 4 °C.
- Für die 1x Schnittlösung NaHCO3, Glukose und Saccharose in ddH2O auflösen und die 20x Brühe zugeben. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität zwischen 315 und 320 mOsm liegt, und lagern Sie die Lösung nicht länger als 1 Woche bei 4 °C.
- Füllen Sie zwei Becher mit 100 mL Schnittlösung und bedecken Sie sie mit Parafilm. Die Lösung wird im Gefrierschrank kalt gestellt, bis sie teilweise gefroren ist (ca. 20 min in einem Gefrierschrank bei -80 °C). Mit einem Gasdispersionsröhrchen beide Becher mit der Schneidelösung mit 95 % O2/5 % CO2 20 Minuten lang auf Eis sprudeln.
- aCSF (Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit) zur Wiederherstellung und Pflege der Scheibe
- Die Zusammensetzung des aCSF ist Tabelle 1 zu entnehmen.
- Bereiten Sie im Voraus eine 20-fache Stammlösung vor und lagern Sie diese bis zu 1 Monat bei 4 °C.
- Für 1x aCSF lösen Sie NaHCO3 und Glukose in ddH2O und fügen die 20x Brühe hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität zwischen 298 und 300 mOsm liegt. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
- aCSF (niedriges Ca2+ für Aufnahmen)
- Die Zusammensetzung des niedrigen Ca2+ aCSF ist in Tabelle 1 aufgeführt.
- Bereiten Sie im Voraus eine 20-fache Stammlösung vor und lagern Sie diese bis zu 1 Monat bei 4 °C.
- Für 1x niedriges Ca2+ aCSF lösen Sie NaHCO3 und Glukose in ddH2O und fügen Sie 20x (CaCl2 und MgCl2 frei) Stamm, CaCl2 und MgCl2 zu den angegebenen Konzentrationen hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität zwischen 298 und 300 liegt. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
- aCSF (Sr2+ für Aufnahmen)
- Die Zusammensetzung des Sr2+ aCSF ist in Tabelle 1 aufgeführt.
- Bereiten Sie im Voraus eine 20-fache Stammlösung vor und lagern Sie diese bis zu 1 Monat bei 4 °C.
- Für 1x Sr2+ aCSF lösen Sie NaHCO3 und Glukose in ddH2O und fügen Sie 20x (CaCl2 und MgCl2 frei) Stamm, SrCl2 und MgCl2 in den angegebenen Konzentrationen hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität zwischen 298 und 300 liegt. Verwenden Sie die Lösung innerhalb von 1 Tag.
- Interne Lösung
- In Tabelle 1 finden Sie die Zusammensetzung der internen Lösung auf K-Gluconat-Basis.
- Um 20 ml interne Lösung herzustellen, geben Sie 15 ml Wasser in molekularbiologischer Qualität in ein 50-ml-Röhrchen. Führen Sie dann die folgenden Schritte auf Eis durch.
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen im Voraus auf 1 M Stammkonzentrationen in molekularbiologischem Wasser vor. Geben Sie (in ml): 2,32 K-Gluconat, 0,24 Na-Gluconat, 0,20 HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure), 0,16 KCl, 0,05 K2-EGTA (Kaliumethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-TETRAESSIGSÄURE), 0,04 MgCl2 in das 50-ml-Röhrchen.
- 100 μl 0,3 M Na3GTP (Guanosin-5'-triphosphat-Natriumsalz) zugeben
- Wiegen Sie 44,08 mg K2 ATP (Adenosin-5'-Triphosphat-Dikaliumsalz) in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 1 ml Wasser in molekularbiologischer Qualität hinzu und geben Sie es dann in ein 50-ml-Röhrchen.
- Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M KOH auf 7,2-7,4 ein. Stellen Sie sicher, dass die Osmolarität zwischen 283 und 289 mOsm liegt.
>2. Vorbereitung der Scheibe
- Vorbereiten von Werkzeugen
- Geben Sie 200 mL aCSF in die Auffangkammer (bestehend aus einem 250 mL Becherglas mit 4 Vertiefungen und Netz) und stellen Sie die Auffangkammer in ein Wasserbad (35 °C).
- Decken Sie die Kammer mit einem Paraffinfilm ab und blasen Sie das aCSF mit einem Glasdispersionsröhrchen mindestens 20 Minuten lang konstant mit 95 % O2/5 % CO2.
- Stellen Sie die Präparierwerkzeuge (Skalpell, abgewinkelte Feinschere, Pinzette, feiner Pinsel, Plastiklöffel) ein.
- Füllen Sie eine 60-ml-Spritze mit ca. 15 mL der eiskalten Schnittlösung aus Schritt 1.1.4.
- Bereiten Sie die Sezierplattform vor, indem Sie Filterpapier auf den Deckel einer Well-Platte legen.
- Bereiten Sie die Schneidekammer vor, indem Sie sie in die Eisschale legen und die Schale mit Eis füllen.
- Richten Sie das Vibratom ein, indem Sie eine Einwegklinge im Klingenhalter befestigen.
- Um eine Transferpipette herzustellen, brechen Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette ab und setzen Sie einen Gummikolben über das abgebrochene Ende.
- Präparieren Sie das Gehirn von Mäusen
- Betäuben Sie das Tier in einer mit 4 % Isofluran gesättigten Kammer, bis die Wirbelsäulenreflexe fehlen.
- Enthaupte das Tier mit einer Guillotine und entferne schnell das Gehirn.
- Machen Sie mit einer Skalpellklinge Nr. 22 einen Schnitt in der Mittellinie von rostral nach kaudal.
- Schälen Sie die Kopfhaut seitlich auf jeder Seite des Kopfes.
- Schneide den Schädel mit einer feinen Schere auf einer Seite von kaudal nach rostral (einschließlich der Seite der Stirnknochen) und achte darauf, das Gehirn nicht zu beschädigen.
- Heben Sie das Schädelstück mit einer Pinzette vom Gehirn ab und kühlen Sie das Gehirn mit der Spritze aus Schritt 2.1.4 schnell mit 15 mL eiskalter Schnittlösung ab.
- Hebe das Gehirn aus dem Schädel.
- Legen Sie das Gehirn in eines der Becherglas, das mit eiskalter Schnittlösung (aus Schritt 1.1.4) gefüllt ist, die mit 95 % O2/5 % CO2 gefüllt ist.
>3. Bereiten Sie Scheiben von Maus-Hypothalamus vor.
- Blockieren Sie das Gehirn für den gewünschten Hirnbereich und Schnittwinkel (z. B. schneiden Sie bei koronalen Hypothalamusschnitten das Gewebe rostral zum Chiasma opticum und kaudal zu den Pons mit einer Klinge ab und stellen Sie sicher, dass der kaudale Block eine ebene Oberfläche senkrecht zur Basis des Gehirns hat).
- Nehmen Sie mit einem abgeschnittenen Stück Filterpapier das Gehirn von der vorderen Seite auf und kleben Sie die hintere Seite mit Sekundenkleber auf die Halteplatte.
- Legen Sie die Halteplatte schnell in die Schneidekammer und füllen Sie sie mit der Schneidelösung aus dem zweiten Becherglas in Schritt 1.1.4.
- Befestigen Sie die Schneidekammer und die Eisschale auf dem Vibratom.
- Definieren Sie den Schnittbereich (anterior und posterior des Gehirns) und beginnen Sie mit dem Schneiden von 250 μm dicken Koronascheiben. Empfohlene Parameter: Geschwindigkeit 0,10 mm/s, Amplitude 2 mm.
- Schneiden Sie die Scheiben auf die passende Größe für den gewünschten Hirnbereich zu.
- Die Scheiben bei 35 °C 30-45 min backen. Nehmen Sie dann die Rückgewinnungskammer aus dem Wärmebad und lassen Sie die Scheiben weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur ziehen. Bewahren Sie die Scheiben für den Rest des Tages bei Raumtemperatur auf und sprudeln Sie das Bad weiterhin konstant mit 95 % O2/5 % CO2.
>3. Ganzzell-Patch-ClampRecording
- Ziehen Sie die Patch-Pipetten.
- Ziehen Sie die Patch-Pipetten unter Verwendung der empfohlenen Parameter für die Ganzzellaufzeichnung aus dem Handbuch des Pipettenabziehers aus dickwandigem Glas auf einen Pipettenwiderstand von 3-5 MΩ.
- Füllen Sie mit einer Mikrospritze (kommerziell oder selbstgemacht) eine Pipettenspitze mit einer gefilterten internen Lösung. Um eine Mikrospritze herzustellen, verbrennen Sie die Spitze einer 1-ml-Spritze und lassen Sie die Spitze fallen, so dass eine lange, feine Spitze entsteht.
- Rufen Sie die Ganzzellenkonfiguration ab.
- Platzieren Sie die Aufzeichnungspipette direkt über der Scheibe und gleichen Sie den Pipettenstrom im Spannungsklemmmodus aus. Üben Sie einen leichten Überdruck auf die Pipette aus und verriegeln Sie den Absperrhahn.
- Wählen Sie eine gesunde Zelle mit einer intakten Membran aus und nähern Sie sich ihr mit der Pipette. Der Überdruck sollte eine leichte Störung im Gewebe verursachen (d.h. eine langsame Welle im Gewebe beim Eintritt).
- Bringen Sie die Pipette langsam mit diagonalen Bewegungen näher an die Zelle, bis die Pipette ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche bildet.
- Lösen Sie die Überdrucksperre. Die Zelle beginnt eine Dichtung zu bilden, und der Widerstand steigt auf über 1 GΩ an. Halten Sie die Zelle in der Spannungsklemme auf -68 mV.
- Ziehen Sie diagonal leicht von der Zelle weg, um überschüssigen Druck von der Zelle zu entfernen.
- Kompensieren Sie die schnelle und langsame Pipettenkapazität.
- Saugen Sie kurz durch das Röhrchen, das mit dem Pipettenhalter verbunden ist, um die Zelle zu durchbrechen und eine Ganzzellenkonfiguration zu erhalten.
- Wechseln Sie in den Zellmodus im Membrantestfenster in einer elektrophysiologischen Datenerfassungs- und Analysesoftware (z. B. Clampex).
- Führen Sie vor jeder Aufzeichnung der Spannungszange einen Membrantest mit derselben Software durch und notieren Sie die relevanten Parameter (Membranwiderstand, Zugangswiderstand und Kapazität) in einem Laborbuch.
- Halten Sie die Temperatur des Aufnahmebades bei 27–30 °C und die Durchflussrate bei 1,5–2,0 mL/min für nachfolgende Experimente.
Tabelle 1: Die Zusammensetzung verschiedener Lösungen.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| Lösungskonzentrationen (mM) |
| in Scheiben schneidend | Normales aCSF | Niedrig Ca2+ aCSF | Sr+ aCSF | Pipette/Intern |
| NaCl | 87 | Nr. 126 | Nr. 126 | Nr. 126 | - |
| Kcl | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 2,5 | 8 |
| CaCl2 | 0,5 | 2,5 | 0,5 | - | - |
| SrCl2 | - | - | - | 2,5 | - |
| MgCl2 | 7 | 1,5 | 2,5 | 1,5 | arabische Ziffer |
| NaH2PO4 | 1,25 | 1,25 | 1,25 | 1,25 | - |
| NaHCO3 | 25 | 26 | 26 | 26 | - |
| Traubenzucker | 25 | 10 | 10 | 10 | - |
| Saccharose | 75 | - | - | - | - |
| K-Gluconat | - | - | - | - | Nr. 116 |
| Na-Gluconat | - | - | - | - | 12 |
| HEPES | - | - | - | - | 10 |
| K2-EGTA | - | - | - | - | 1 |
| K2ATP | - | - | - | - | 4 |
| Na3GTP | - | - | - | - | 0,3 |