Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. pHuC_Mermaid Plasmid-Erzeugung
HINWEIS: Mermaid ist ein Biosensor, der durch die Paarung der Spannungsmessdomäne (VSD) des Spannungssensors Ciona intestinalis (jetzt Ciona robusta), der Phosphatase (Ci-VSP) enthält, mit den Fluorophoren des Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET)-Partners Umi-Kinoko Green (mUKG: Donor) und einer monomeren Version des orange-emittierenden fluoreszierenden Proteins Kusabira Orange (mKOk: Akzeptor) entwickelt wurde. Bei diesem Biosensor erhöhen Konformationsänderungen der VSD-Domäne, die durch Membrandepolarisation induziert werden, die Nähe der fluoreszierenden Donor- und Akzeptorproteine und erhöhen somit den Energietransfer zwischen ihnen (Erhöhung des FRET-Verhältnisses). Der VSD gewährleistet die effiziente Lokalisierung des Biosensors an der Plasmamembran. Die neuronale Expression des Biosensors (im Rückenmark ist das Signal sowohl in Interneuronen als auch in Motoneuronen nachweisbar) wird durch Klonierung des Mermaid Open Reading Frame (ORF) unter dem Zebrafisch-Pan-Neuronal-Promotor HuC erreicht.
- Amplifizieren Sie durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) den Mermaid Open Reading Frame (ORF) aus dem pCS4+ Mermaid-Plasmid mit Pfu (Korrekturlesen) DNA-Polymerase unter Verwendung des T3 Universal Primers und des Mermaid Sma IPrimers (5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA), um eine SmaI Restriktionsstelle stromaufwärts des Mermaid ORF einzufügen.
- Verwenden Sie die folgende PCR-Mischung: 0,5 μl Pfu-DNA-Polymerase, 7,5 μl des spezifischen 10x-Puffers, 1 μl 10 mM Desoxynukleotidtriphosphate (dNTPs), 2,5 μl Dimethylsulfoxid (DMSO), 0,5 μl (50 ng) der Plasmidzubereitung und 1 μl 20-μM-Stammlösungen jedes Primers in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
- Erhitzen Sie die PCR-Mischung 15 s lang bei 95 °C, grundieren Sie sie 15 s lang bei 50 °C und verlängern Sie sie für 4 min bei 72 °C für insgesamt 35 Zyklen.
- Reinigen Sie das spezifische stumpfe PCR-Produkt mit einem kommerziellen Gelaufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Klonieren Sie das DNA-Fragment in den stumpfen pCMV-SC-Vektor gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Linearisieren Sie das Meerjungfrauen-positive Plasmid (genannt pCMV-SC_Mermaid) mit dem SmaI-Restriktionsenzym für die anschließende Insertion des HuC-Promotors.
- Richten Sie die Restriktionsreaktion wie folgt ein: 0,5 μl (10 U) SmaI-Restriktionsenzym, 2 μl des 10x-Puffers des Kits und 5 μg Plasmid-DNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Inkubieren Sie die Reaktion 1 h lang bei 25 °C.
- Reinigen Sie das verdaute Plasmid mit einem kommerziellen Gelaufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- PCR-amplifizieren Sie den HuC-Promotor (pHuC) mit Pfu-DNA-Polymerase und genomischer Zebrafisch-DNA als Template unter Verwendung eines Paares von HuC-spezifischen Primern (HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA und HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG) und überspannen eine 3.150-bp-Region stromaufwärts des ATG.
- Richten Sie die PCR-Mischung nach folgendem Schema ein: 0,5 μl Pfu-DNA-Polymerase, 7,5 μl des spezifischen 10x-Puffers, 1 μl 10 mM dNTPs, 2,5 μl DMSO, 200 ng genomische DNA und 1 μl 20-μM-Stammlösungen jedes Primers in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
- Nach einem ersten Schritt von 2 min bei 95 °C erhitzen Sie die PCR-Mischung für 15 s bei 95 °C, grundieren Sie sie für 15 s bei 50 °C und verlängern Sie sie für 4 min bei 72 °C für insgesamt 35 Zyklen.
- Reinigen Sie das spezifische stumpfe PCR-Produkt mit einem kommerziellen Gelaufreinigungskit gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Eine äquimolare Menge des gereinigten pCMV-SC_Mermaid (Schritt 1.5) und der pHuC-DNA (Schritt 1.7) wird unter Verwendung von 1 μl T4-DNA-Ligase und 1 μl des spezifischen 10X-Puffers in einem Gesamtvolumen von 10 μl ligiert. Die Reaktion wird 16 Stunden lang bei 4 ΰC inkubiert.
- Ein Aliquot kompetenter Zellen wird mit 5 μl der Ligationsreaktion (Schritt 1.8) gemäß den Anweisungen des Herstellers transformiert.
- Selektieren Sie die pHuC-positiven Klone (pHuC_Mermaid), wobei der Promotor durch einen Sal I-EcoRV-Doppelaufschluss in die richtige Ausrichtung eingefügt wurde (die SalI-Restriktionsstelle wurde in Schritt 1.6 stromaufwärts des Promotorfragments eingefügt, während die EcoRV-Restriktionsstelle stromabwärts der Polyadenylierungsregion PolyA des pCMV-SC-Plasmids positioniert ist).
- Richten Sie die Restriktionsreaktion wie folgt ein: 0,5 μl (10 U) der Sal I- und EcoRV-Restriktionsenzyme, 2 μl des Kit10X-Puffers und 1 μg pHuC_Mermaid DNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl. Inkubieren Sie die Reaktion 1 h lang bei 37 °C. Führen Sie die Reaktionen auf einem Agarosegel durch.
>2. Mikroinjektion von Embryonen
- Übertragen Sie die befruchteten Eier aus Wildtyp- (Stamm AB) oder Sod1-G93R adulten Zebrafischen mit einer Kunststoffpipette in eine 10 mm Petrischale.
- Spülen Sie die Embryonen in kaltem (4 °C) Fischwasser ab und mikroinjizieren Sie sie sofort mit einem Mikroinjektor mit 200 μg pHuC_Mermaid Plasmid in das Eigelb (für eine allgemeine und detaillierte Beschreibung des Mikroinjektionsverfahrens).
- Mit einer Plastikpipette werden die Embryonen in eine Petrischale überführt und in Fischwasser bei 28 °C inkubiert, bis sie das gewünschte Entwicklungsstadium (20-24 h nach der Befruchtung, hpf) für die folgenden Analysen erreicht haben.
>3. Spontane Tail-Coiling-Analyse
HINWEIS: Bewerten Sie das spontane Schwanzwickelverhalten bei 20-24 hpf-Embryonen mit oder ohne das Medikament Riluzol.
- Übertragen Sie einen Embryo in eine runde 90-mm-Petrischale, die mit Fischwasser gefüllt ist, das 0,2 % DMSO (Riluzolvehikel) enthält, und dechorionieren Sie es manuell mit zwei Juwelierzangen mit scharfen Spitzen. Inkubieren Sie den Embryo für 5 Minuten.
- Erkennen Sie das Aufwickeln des Hecks bei Raumtemperatur (RT) während einer 1-minütigen Videoaufzeichnung mit einer Digitalkamera, die an einem Stereomikroskop montiert ist. Erfassen Sie Zeitreihen mit einer Zeitauflösung von 30 Bildern/s.
- Berechnen Sie die Häufigkeit von spontanen Schwanzwindungen, indem Sie die Anzahl der Biegungen (sowohl kontralateral als auch ipsilateral) pro Zeiteinheit zählen.
- Um die Wirkung des Medikaments Riluzol zu bewerten, verwenden Sie vorsichtig eine Pasteurpipette aus Kunststoff, um den Embryo in eine neue 90-mm-Petrischale zu übertragen, die mit Fischwasser gefüllt ist, das 5 μM Riluzol enthält.
- Inkubieren Sie den Embryo 5 Minuten lang, bevor Sie ein 1-minütiges Video aufnehmen und die Verhaltensanalyse wie oben beschrieben durchführen.
>4. Bildgebungsaufbau für die Visualisierung von Meerjungfrauen-Biosensoren in lebenden Embryonen: gleichzeitige Detektion von Spender- und Akzeptorsignalen
- Montieren Sie die 20 bis 24 hpf großen Embryonen in 1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in Fischwasser bei 37 °C in einer 35-mm-Bildgebungsschale mit Glasboden. Richten Sie die Embryonen auf die Seite aus. Warten Sie, bis die Agarose bei Raumtemperatur fest wird.
- Übertragen Sie die Bildgebungsschale auf den Tisch einer inversen Konfokalschüssel, die auf einem inversen Mikroskop montiert ist. Identifizieren Sie Motoneuronen, die den Biosensor exprimieren, mit einem 20-fachen Objektiv (0,7 numerische Apertur, NA), indem Sie das mUKG mit der 488 nm Argon-Laserlinie anregen und seine Emission zwischen 495 und 525 nm aufzeichnen.
- Für eine FRET-Messung wird mUKG, der Donor des FRET-Paares, mit der 488-nm-Laserlinie angeregt. Mit einem Resonanzscanner, der mit 8.000 Hz im bidirektionalen Modus arbeitet, können Sie gleichzeitig die vom Donor emittierte Fluoreszenz (zwischen 495 und 525 nm) und die vom mKOk-Akzeptor emittierte Fluoreszenz (zwischen 550 und 650 nm, FRET-Kanal) erfassen. Falls verfügbar, verwenden Sie den 473-nm-Laser.
Anmerkung: Die Anregungseffizienz des Donors wird leicht reduziert (85% statt 93% bei 488 nm), aber die Kreuzanregung des Akzeptors wird ebenfalls reduziert (von 17% bei der 488 nm auf 9% bei der 473 nm Laserlinie).
- Um Phototoxizität und Fluorophorbleiche zu reduzieren, minimieren Sie die Beleuchtung der Probe, indem Sie die Leistung der Laserlinie reduzieren (im Strahlengangfenster der Erfassungssoftware).
- Optimieren Sie die Anregung, um sie an die Verstärkungs- und Offset-Parameter anzupassen, die zu Beginn des Experiments eingestellt und während der gesamten Sitzung konstant gehalten werden. Um den Versatz festzulegen, ändern Sie die Farbe des Bildes in Intensitätswerte (mithilfe der Nachschlagetabelle Q) und drehen Sie beim Scannen bei ausgeschaltetem Laser den Versatzregler (intelligenter Versatz), sodass die Hintergrundpixel eine Intensität haben, die etwas höher als Null ist. Drehen Sie bei derselben Nachschlagetabelle durch Einschalten des Lasers während des Scannens den Gain-Regler (Smart Gain), um das Signal-Rausch-Verhältnis zu maximieren, und achten Sie darauf, gesättigte Pixel zu vermeiden.
- Mit einer offenen Lochblende (2 luftige Einheiten) können Sie 16-Bit-Bilder aufnehmen, um einen ausreichenden Dynamikbereich für quantitative Analysen bereitzustellen. Vermeiden Sie die Mittelwertbildung, um die Erfassungsgeschwindigkeit zu erhöhen und das Photobleaching zu minimieren.
- Wählen Sie im Softwareerfassungsfenster eine Bildfeldgröße von 512 x 64 Pixel (Pixelgröße: 605 nm) aus dem Dropdown-Menü aus.
- Wählen Sie im Fenster für den Aufnahmemodus xyt (Zeitraffer auf einer einzelnen xy-Ebene) aus dem Dropdown-Menü aus und zeichnen Sie die Änderungen der Spannung des spinalen Neurons des Embryos auf, indem Sie eine einzelne xy-Ebene erfassen und die Erfassungsparameter so einstellen, dass alle 30 ms für 1 Minute ein Bild aufgenommen wird.
- Um die Wirkung der Verabreichung von Riluzol auf die Membrandepolarisation im selben Neuron zu bewerten, erfassen Sie 5 Minuten nach der Zugabe von Fischwasser mit 5 μM Riluzol einen neuen Datensatz
.
- Verwenden Sie für die FRET-Analyse das ImageJ-Makro Biosensor_FRET (das Einzelketten-FRET-Biosensoren ausdrückt).
- Bewerten Sie das Basalmembran-FRET-Verhältnis jedes Neurons bei t1 als ((FRET-Mittelwert - FRET-Hintergrund)/(Donormittelwert - Donorhintergrund)), wobei FRET und Donor-Mittelintensität die mittlere Fluoreszenzintensität ist, die in derselben Region of Interest (ROI) berechnet wird, die für jeden erfassten Kanal um die Zelle gezeichnet wird, und FRET und Donor-Hintergrund die mittlere Fluoreszenzintensität ist, die in einem ROI des Sichtfelds ohne die fluoreszierende Probe berechnet wird.
Anmerkung: Eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Nutzung des Plugins finden Sie auf der Website der www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret .
- Verwenden Sie eine Grafiksoftware, um die Frequenz, Amplitude und Dauer der Depolarisation zwischen verschiedenen experimentellen Paradigmen zu vergleichen. Vergleichen Sie zwei Gruppen mit einem ungepaarten Student-t-Test und betrachten Sie Mittelwerte als statistisch unterschiedlich, wenn P <0,05.
