Elektrophysiologische Aufzeichnung der Spannungsantworten von retinalen Photorezeptoren der Drosophila auf Lichtreize

Zusammenfassung

Quelle: Juusola, M., et al. Elektrophysiologische Methode zur Aufzeichnung intrazellulärer Spannungsantworten von Drosophila-Photorezeptoren und Interneuronen auf Lichtreize in vivo. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video beschreibt das Protokoll zur elektrophysiologischen Aufzeichnung der Photorezeptoraktivität im Auge einer immobilisierten Drosophila, das eine präzise Messung von Spannungsänderungen als Reaktion auf Lichtreize ermöglicht.

Protokoll

>1. Aufzeichnung von R1-R6 Photorezeptoren

1. Seien Sie beim Betrieb des Mikroelektrodenverstärkers immer geerdet (z. B. durch Berühren der Metalloberfläche des Faradayschen Käfigs oder des Antivibrationstisches), da dies verhindert, dass versehentlich eine statische Ladung an den Kopftisch abgegeben wird, die die Schaltung beschädigen könnte.
2. Beleuchten Sie die Stange der Fliegenvorbereitungsplattform von oben mit zwei Schwanenhals-Lichtleitern (Abbildung 1A) (mit der Kaltlichtquelle im Faradayschen Käfig), so dass der Fliegenhalter in der bevorzugten Position unter genauer Sichtkontrolle auf der Stange platziert werden kann.
3. Montieren Sie den Fliegenhalter (mit der Fliege darin!) an der Stange der Fliegenvorbereitungsplattform. Drehen Sie den Fliegenhalter so, dass das linke Auge der Fliege direkt zum Untersucher zeigt (Abbildung 1B).
4. Führen Sie die stumpfe Referenzelektrode mit einem kleinen groben Mikromanipulator vorsichtig durch die Augenflecken der Fliege in die Kopfkapsel ein, während Sie die Präparation durch das Stereomikroskop beobachten (Abbildung 1C). Schieben Sie die Elektrode nicht zu tief, da dies das Fliegengehirn schädigen kann.
   1. Alternativ können Sie die Referenzelektrode in die Rückseite des Brustkorbs einführen. Stellen Sie immer sicher, dass die Fliege gesund aussieht (bewegt ihre Antennen) und dass ihre Augen intakt und nicht versehentlich beschädigt sind. Wenn die Vorbereitung nicht ganz makellos aussieht, bereiten Sie eine neue Fliege für die Experimente vor.
5. Treiben Sie die scharfe Aufzeichnungsmikroelektrode durch eine mit Vaseline bedeckte kleine Öffnung in das linke Auge. Verwenden Sie eine hohe Vergrößerung im Stereomikroskop und verschieben Sie die Lichtleiter und die Fokusebene so, dass die Position der Elektrodenspitze durch ihre Reflexionsmuster in 3D sichtbar wird.
   HINWEIS: Abbildung 1D zeigt, wie der Kopf der Fliege (in Bezug auf den Winkel, in dem die Aufzeichnungsmikroelektrode in das Auge eintritt) für Photorezeptoraufnahmen positioniert werden sollte. Die Elektrode in das Auge zu treiben, ohne sie zu brechen, ist die schwierigste Phase des Experiments. Wenn die Elektrodenspitze die kleine Öffnung im Auge verfehlt und auf die Hornhaut trifft, bricht sie normalerweise.
6. Schalten Sie den Mikroelektrodenverstärker ein, sobald sich beide Elektroden fest im Präparat befinden und in elektrischem Kontakt mit den Körperflüssigkeiten der Fliege stehen.
7. Schalten Sie die Kaltlichtquelle (im Faradayschen Käfig) aus und ziehen Sie den Netzstecker. Schließen Sie den Stecker an die zentrale Masse an, um durch Erdschleifen verursachtes elektrisches Rauschen zu minimieren, und bewegen Sie die Schwanenhals-Lichtleiter weg, damit das Kardanarmsystem frei um das Außenzelt herum bewegt werden kann. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus, um sicherzustellen, dass die Fliegenvorbereitung jetzt in relativer Dunkelheit stattfindet.
8. Messen Sie den Widerstand der Aufzeichnungselektrode im Auge. Verwenden Sie nur Aufzeichnungselektroden mit einem Widerstand von 100 - 250 MΩ.
   Anmerkung: Es ist praktisch unmöglich, qualitativ hochwertige intrazelluläre Aufzeichnungen mit einer Elektrode von <70 MΩ zu erzielen. Wenn der Widerstand <80 MΩ beträgt, ist es wahrscheinlich, dass die Elektrodenspitze gebrochen ist. Schalten Sie in diesem Fall den Verstärker aus und wechseln Sie die Aufnahmeelektrode.
9. Stellen Sie den Verstärker auf den Stromzangen- (CC) oder Bridge-Aufnahmemodus ein. Heben Sie eine beliebige Spannungsdifferenz zwischen der Aufzeichnungs- und der Referenzelektrode auf, da beide nun im elektrisch miteinander verbundenen extrazellulären Raum ruhen, indem Sie den Signaloffset (Aufnahmespannung) auf Null setzen. Verfolgen Sie die Änderungen des Signal-Offsets mit der Displayanzeige des Verstärkers oder einem Oszilloskop-Bildschirm.
10. Warten Sie 2-3 Minuten, bis sich das Fliegenauge an die Dunkelheit angepasst hat.
11. Treiben Sie die Spitze der Aufzeichnungselektrode in kleinen Schritten von 0,1 bis 1 Mikrometer tiefer in das Auge. Tun Sie dies mit einem Piezo-Schritter der x-Achse eines ferngesteuerten Mikromanipulators oder durch sanftes Drehen des feinauflösenden Knopfes eines manuellen Manipulators.
12. Stimulieren Sie das Fliegenauge mit kurzen (1 - 10 ms) Lichtblitzen, während die Aufzeichnungselektrode in das Gewebe vorgeschoben wird.
    Anmerkung: Wenn die Aufzeichnungselektrode in der Netzhaut positioniert ist und das Auge normal funktioniert, verursacht jeder Lichtblitz einen kurzen und kleinen Abfall der Spannung (0,2 - 5 mV Hyperpolarisation), der als Elektroretinogramm (ERG) bezeichnet wird. Diese Veränderung des Feldpotentials des extrazellulären Raums wird durch die kollektive Reaktion der Netzhautzellen auf Licht verursacht.

Ergebnisse

Abbildung 1. Positionierung des Fliegenhalters und der Elektroden für die Experimente. (A-B) Der Fliegenhalter wird auf der Aufnahmeplattform platziert, die auch die Temperaturregelung über ein Peltier-Element ermöglicht (A: weiße runde Plattform in der Mitte). Der Kardanarm ermöglicht eine exakte Positionierung des Lichtreizes in gleichem Abstand (über x,y-Rotation) um die Fliege, wobei die Licht...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Stereo-Zoom-Mikroskop für die Vorbereitung der Fliege	Olymp	SZX12 DFPLFL1,6x PF Okulare: WHN30x-H/22	Geeignet für ~150-fache Vergrößerung mit großem Arbeitsabstand; maßgeschneidertes schweres Tischmontagestativ aus Stahl
Stereomikroskop im intrazellulären Aufbau	· Olymp	Olympus SZX7; Okulare: WHN30x-H/22	30X Okulare werden benötigt, um die Reflexionen der Elektrodenspitze gut zu sehen, wenn sie durch das kleine Hornhautloch in das Auge getrieben
Nikon Mikroskop	Nikon SMZ645; Okulare: C- W30x/7
Anti-Vibrations-Tisch	Melles Griot	Mit metrischen M6-Löchern auf dem Steckbrett	Unsere maßgeschneiderten Rigs haben ein großes Loch, das durch das dicke Steckbrett gebohrt wurde und das den Mast der Fliegenvorbereitungsplattform (in dem sich ein Kupferkühlkörper mit Elektronik befindet) von unten hereinlässt
Newport
Mikromanipulatoren	Narishige	Narishige NMN-21	In unseren intrazellulären Aufbauten werden verschiedene Mikromanipulatorsysteme verwendet, um die ShaP-Aufzeichnungselektroden in das Fliegenauge zu treiben. Alle aufgeführten Manipulatoren liefern erfolgreich lang anhaltende stabile Aufzeichnungen von Drosophila-Photorezeptoren und LMCs.
Huxley Bertram	Huxley xyz-Achse mit feiner manueller Steuerung
Sensapex	Sensapex Dreiachsigkeit
Märzhäuser	Märzhäuser DC-3K mit zusätzlichem x-Achsen-Piezo-Stepper und MS 314 Controller
Magnetische Ständer	Jeder Magnetfuß mit Ein-/Ausschalter ist geeignet		Zum Beispiel, um Kabel im Faradayschen Käfig zu verwalten
Elektroden-Halterungen	Harvard-Apparatur	ESP/W-F10N
Silberdraht	Welt Präzisionsinstrumente	AGW1510	0,3 - 0,5 mm Durchmesser; muss für die Elektrodenhalter chloridisiert werden
Faseroptische Lichtquelle	Viele verschiedene, einschließlich Olympus
Glasfaser-Bündel	UltraFine-Technologie		Um den LED-Lichtreiz an das Kardanarmsystem abzugeben. Wir verwenden sowohl Flüssigkeits- als auch Quarz-Lichtleiter (Bereich von UV bis IR)
Dornlabore
Fliegenkathetiker-Röhrchen		P80-50P 50ml Cent. Tube PP., Packung à 100 Stück	Schneiden Sie den konischen Boden von 50 ml Kunststoffzentrifugenröhrchen ab und kleben Sie eine 1 ml Pipettenspitze darauf.
Digitales Erfassungssystem	Nationale Instrumente
-/Spannungs-Klemm-Mikroelektrodenverstärker mit einer Elektrode	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ Produkte/Verstärker/sec-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	Hervorragender Performer!
Kopf-Bühne	Standard (+/- 150 nA)	Für npi SEC-10LX
LED-Lichtquellen und Treiber	2-Kanal OptoLED (Cairn Research Ltd., Großbritannien)		Viele unserer Stimulussysteme werden im eigenen Haus gebaut
Selbst entworfen und konstruiert
Akquisitions- und Analysesoftware	Viele Unternehmen zur Auswahl		Biosyst; kundenspezifisches Matlab-basiertes System für experimentelle und theoretische Arbeiten im Juusola-Labor
PC oder Mac			Stellen Sie sicher, dass der PC oder Mac mit dem Datenerfassungssystem und der Software kompatibel ist.
Kardanarm-System	Selbst entworfen und konstruiert		Bereitstellung einer genauen x,y,z-Positionierung der Lichtstimuli
Peltier-Temperiersystem	Selbst entworfen und konstruiert
Faradayscher Käfig	Selbst konstruiert		Abschirmung gegen elektromagnetisches Rauschen
Kapillaren aus gefilamentiertem Borosilikatglas		Außendurchmesser: 1 mm
Innendurchmesser: 0,5 - 0,7 mm
Filamentierte Quarzglaskapillaren		Außendurchmesser: 1 mm
Innendurchmesser: 0,5 - 0,7 mm
Pipetten-Abzieher	Sutter Instrument Unternehmen	Modell P-2000 Laser Flaming/Brauner Mikropipettenabzieher	Für Borosilikat-Referenzelektroden verwenden Sie das voreingestellte Programm #11 (Patch-Elektroden): Hitze = 350; Filament = 4; Geschwindigkeit 36; Verzögerung = 200).1.2.1). Verwenden Sie für Borosilikat-Aufnahmeelektroden das voreingestellte Programm #12 (dies zieht in der Regel gute herkömmliche Kreuze für Photorezeptor-Aufnahmen): Hitze = 355; Filament = 4; Geschwindigkeit 50; Verzögerung = 225; Zug = 150. Bei LMC-Aufnahmen, die Elektroden mit feineren Spitzen benötigen, müssen diese Werte angepasst werden. Für das Ziehen von Quarzkapillaren schlägt das P-2000-Handbuch Programme für Mikroelektroden mit feiner Spitze. Die voreingestellten Parameter dieser Programme dienen als nützliche Ausgangspunkte Für systematische Modifikationen zur Erzeugung von Elektroden mit gutem Eindringerfolg und geringem Aufzeichnungsrauschen.
Extrazelluläre Ringerlösung für die Referenzelektrode	Chemikalien von Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, Saccharose	Siehe das Rezept im Abschnitt Protokoll
3 M KCl-Lösung zum Befüllen der filamentierten Aufzeichnungsmikroelektrode	Salze von Fisher Scientific	10010310, KCl
Vaseline	Vaselin

wird Strom