Überwachung der elektrischen Signale der afferenten Neuronen in einer immobilisierten Zebrafischlarve

Zusammenfassung

Quelle: Lunsford, E. T., et al. Aktivität von Neuronen der hinteren Seitenlinie beim Schwimmen im Zebrafisch. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt die Aufzeichnung von elektrischen Signalen von den afferenten Neuronen in einer gelähmten Zebrafischlarve, indem eine Mikropipette in der Nähe des Ganglions der Seitenlinie positioniert und eine lose Dichtung für die Signalerfassung gebildet wird. Die extrazelluläre Lösung erhält während dieses Prozesses die neuronale Lebensfähigkeit.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung von Materialien für elektrophysiologische Aufzeichnungen

1. Stelle eine Aufnahmeschale mit Silikonelastomerboden her.
   1. Geben Sie eine dünne Schicht selbstmischender Silikonelastomerkomponenten (z. B. Sylgard) in eine abgedeckte Gewebekulturschale mit Glasboden, bis sie mit dem Rand einer flachen Vertiefung übereinstimmt. Ungefähr 0,5 mL sind ausreichend.
   2. Das Gericht abdecken und mindestens 48 Stunden bei Raumtemperatur aushärten.
2. Machen Sie Seziernadeln.
   1. Versorgen Sie mit einem Gleichstromnetzteil einen 100-ml-Becher mit Ätzmittel (3M KOH) mit einer negativen Ladung (5 V) und schließen Sie einen Wolframdraht (0,002 Zoll; 50,8 μm Durchmesser) an den positiv geladenen Ausgang an.
      Vorsicht: Negative und positive Drähte sollten sich bei diesem Vorgang nicht berühren, da die Gefahr besteht, dass Funken entstehen, die eine potenzielle Brandgefahr darstellen können.
   2. Ätzen Sie den Wolframdraht, indem Sie die Spitze schnell und wiederholt in das Ätzbad tauchen, bis sich die Spitze zu einer scharfen Spitze verjüngt. Schneiden Sie den Draht unter einem Stereomikroskop mit einer Rasierklinge etwa 1 mm von der Spitze entfernt ab. Wiederholen Sie dies noch dreimal und führen Sie dann mit einer feinen Pinzette Stecknadeln in die ausgehärtete Aufnahmeschale ein.
3. Bereiten Sie die Aufnahmeelektroden vor.
   1. Ziehen Sie mit einem horizontalen Mikropipettenabzieher mit Box-Filament ein Kapillarrohr aus Borosilikatglas (Innendurchmesser: 0,86 mm, Außendurchmesser: 1,50 mm) in Elektroden mit einer Spitze von 30 μm Durchmesser und leichter Verjüngung (Abbildung 1 Ai), die zur Aufzeichnung afferenter Neuronen von der hinteren Seitenlinie verwendet werden.
   2. Ziehen Sie ein zusätzliches Kapillarrohr aus Borosilikatglas in ein Elektrodenpaar mit kleineren Spitzendurchmessern (1-5 μm). Halten Sie eine Elektrode in jeder Hand und führen Sie die Spitzen vorsichtig übereinander, um sie in einem Winkel von ~30° zu brechen. Polieren Sie die abgeschrägte Spitze mit einer Mikroschmiede, bis sie glatt ist.
4. Generieren Sie das Protokoll in elektrophysiologischen Aufzeichnungsprogrammen.
   1. Stellen Sie sicher, dass der richtige Kopftisch mit dem Eingang Kanal 1 auf der Rückseite des Strom- und Spannungszangenverstärkers der Mikroelektrode für die afferenten Neuronenaufzeichnungen verbunden ist.
      HINWEIS: Die Computerspezifikationen für den Strom- und Spannungszangenverstärker erfordern mindestens einen Prozessor mit 1 GHz oder besser, Windows XP Pro oder Mac OS X 10.46.6, ein CD-ROM-Laufwerk mit 512 MB RAM, 500 MB Festplattenspeicher und 2 USB-Anschlüsse.
   2. Öffnen Sie die computergesteuerte Verstärkersoftware.
   3. Stellen Sie Kanal 1 in den Stromzang-Modus, indem Sie auf die IC-Taste klicken.
   4. Geben Sie den folgenden Parameter auf der Registerkarte I-Clamp 1 ein. Primärausgang: 100x AC-Membranpotenzial (100.000 mV/mV), Verstärkung: 1.000, Bessel: 1 kHz, AC: 300 Hz, Oszilloskop: Bypass. Sekundärer Ausgang: 100x AC Membranpotential (100 mV/mV), Verstärkung: 1, Tiefpassfilter: 10 Hz.
   5. Speichern Sie den Kanalparameter als Ch1_Aff.
   6. Installieren und öffnen Sie die Elektrophysiologie-Software für Patchklemmen.
   7. Klicken Sie auf Konfigurieren und wählen Sie Lab Bench, um die analogen Signale einzurichten, indem Sie Ch1_Aff zu den Digitizer-Kanälen (z. B. Analog IN #0 und Analog IN #1) hinzufügen, die über ein BNC-Koaxialkabel mit den entsprechenden skalierten Ausgängen von Kanal 1 des Verstärkers verbunden sind. Klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Die Mindestanforderungen an den Computer für den Digitizer sind: ein Prozessor mit 1 GHz oder besser, Windows XP Pro oder Mac OS X 10.46.6, ein CD-ROM-Laufwerk mit 512 MB RAM, 500 MB Festplattenspeicher und 2 USB-Anschlüsse.
   8. Klicken Sie auf Acquire und wählen Sie New Protocol.
   9. Wählen Sie auf der Registerkarte "Modus/Rate" die Option "Gap Free" aus. Stellen Sie unter "Acquisition Mode" die Testlänge entweder auf "Verfügbaren Speicherplatz verwenden (d. h. bis zum Stoppen aufnehmen") oder auf eine gewünschte festgelegte Dauer (hh:mm:ss) ein, und stellen Sie dann die Abtastrate pro Signal (Hz) auf 20.000 ein, um die Auflösung zu maximieren.
   10. Wählen Sie auf der Registerkarte Eingänge die analogen IN-Kanäle aus, die zuvor (in Schritt 1.4.6) konfiguriert wurden, und wählen Sie Ch1_Aff für den entsprechenden Kanal aus.
   11. Wählen Sie auf der Registerkarte Ausgänge die Option Cmd 0 und Cmd 1 für Kanal #0 bzw. Kanal #1 aus.
       1. Verbinden Sie Kanal 1 Befehl am Verstärker über ein BNC-Koaxialkabel mit dem Analogausgang 0 am Digitizer.
   12. Die restlichen Registerkarten können unter den Standardeinstellungen verbleiben. Klicken Sie auf OK und speichern Sie das Protokoll.

>2. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie die Hank-Lösung vor: 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na₂HPO₄, 0,44 mM KH₂PO₄, 1,3 mM CaCl₂, 1,0 mM MgSO₄, 4,2 mM NaHCO₄; pH 7,3. Verdünnen Sie die Hank-Lösung auf 10 %, indem Sie dem Vorrat die entsprechende Menge entionisiertes Wasser hinzufügen.
2. Bereiten Sie die extrazelluläre Lösung vor: 134 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,2 mM MgCl₂, 2,1 mM CaCl₂, 10 mM Glukose und 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,8 eingestellt mit NaOH. Die extrazelluläre Lösung wird durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm vakuumfiltriert.
3. Bereiten Sie α-Bungarotoxin vor: Löse 1 mg lyophilisiertes α-Bungarotoxin in 10 ml extrazellulärer Lösung, um eine Verdünnung von 0,1 % zu erzeugen.
4. Euthanasielösung herstellen: 50 % (mg/L) gepuffertes MS-222 in pharmazeutischer Qualität in 10 % Hank-Lösung.
   ACHTUNG: α-Bungarotoxin ist ein starkes Neurotoxin, das die Muskeln lähmt, indem es cholinerge Rezeptoren blockiert. Handschuhe sind erforderlich und es wird empfohlen, beim Umgang mit dem Gelähmten einen Augenschutz zu tragen.

>3. Vorbereitung der Larven für elektrophysiologische Aufzeichnungen

1. Immobilisieren Sie Zebrafischlarven.
   1. Verwenden Sie Larven aus der im Labor gezüchteten Population von Zebrafischen (Danio rerio; 4-7 Tage nach der Befruchtung) und halten Sie sie in Embryonallösung (10%ige Hank-Lösung) bei 27 °C.
   2. Übertragen Sie die Larve mit einer Transferpipette mit großer Spitze aus dem Gehäuse in eine kleine Petrischale (35 mm) und entfernen Sie so viel wie möglich von der umgebenden Lösung.
      Anmerkung: Die Entnahme der Embryonallösung verhindert eine Verdünnung des Lähmungsmittels und erhöht dessen Wirksamkeit. Die Ecke eines Arbeitstuchs kann verwendet werden, um die restliche Embryonallösung abzuleiten, und es ist wichtig, die Larven nicht zu berühren oder sie der Luft auszusetzen.
   3. Die Larven werden ca. 5 Min. lang in 10 μl 0,1 % α-Bungarotoxin getaucht < > Anmerkung: Die Zeit, die benötigt wird, um die Larven zu immobilisieren, variiert zwischen den Präparaten. Eine gesunde Vorbereitung hängt von der genauen Überwachung des anhaltend schnellen Blutflusses und der verminderten motorischen Reaktionen ab. Eine kurze Überbelichtung mit dem Lähmungsmittel kann zu einer langsamen Verschlechterung der allgemeinen Gesundheit des Präparats führen, selbst nach einer gründlichen Auswaschung. Es ist am besten, eine Wäsche aufzutragen, bevor die Larve vollständig immobilisiert ist, solange sie noch Anzeichen von subtilen Muskelvibrationen zeigt.
   4. Waschen Sie die gelähmte Larve mit der extrazellulären Lösung und baden Sie sie 10 Min.
      Anmerkung: Die Auswaschung ermöglicht es der Larve, von subtilen Muskelvibrationen zu einer vollständigen Lähmung überzugehen. Außerdem ist α-Bungarotoxin ein Antagonist der nikotinischen Acetylcholinrezeptor (nAChR) α9-Untereinheit, die eine kritische Komponente des endogenen Rückkopplungskreislaufs ist, den dieses Protokoll beobachtet; Es hat sich jedoch gezeigt, dass dieser Effekt in Xenopus- und Zebrafisch-Haarzellen nach einer 10-minütigen Auswaschung reversibel ist.
2. Stecken Sie Fische in die Aufnahmeschüssel.
   Anmerkung: Eine Anästhesie (z. B. MS-222, Tricain) ist bei der Zubereitung von Zebrafischlarven (4-7 dpf) nicht erforderlich, da sie die Tiergesundheit beeinträchtigt. Tatsächlich sind Zebrafischlarven von bestimmten Wirbeltierprotokollen ausgenommen.
   1. Bewegen Sie die Larve mit einer Transferpipette aus dem extrazellulären Lösungsbad in die Aufzeichnungsschale mit Silikonboden. Füllen Sie den Rest der Schale mit der extrazellulären Lösung.
   2. Positionieren Sie die Larven unter einem Stereomikroskop vorsichtig mit einer feinen Pinzette über der Mitte der Silikonmatte, mit der seitlichen Seite nach oben, wobei das vordere bzw. hintere Ende des Körpers von links nach rechts verläuft. Fassen Sie dann mit einer feinen Pinzette einen geätzten Stift aus der Silikonmatte und führen Sie den Stift orthogonal zum Silikon durch die dorsale Chorda der Larven direkt dorsal zum After ein. Führen Sie den zweiten Stift durch die Chorda in der Nähe des Endes des Schwanzes und den dritten Stift durch die Chord-Rückseite der Gasblase (Abbildung 1B).
      Anmerkung: Beim Einsetzen von Stiften ist es wichtig, die Mitte der Lochdrüsenbreite zu erreichen, um zu verhindern, dass der Blutfluss beeinträchtigt oder die umgebende Muskulatur beschädigt wird. Die Chorda ist dorsal des Nervus der hinteren Seitenlinie, so dass bei richtiger Fixierung keine Schädigung der sensorischen Neuronen der Seitenlinie zu erwarten ist. Nach dem ersten Kontakt einsetzen, um das umliegende Gewebe nicht zu stören. Im Idealfall beträgt der Durchmesser des Stifts weniger als die Hälfte der Breite des Notochords, um ein sauberes Einführen zu gewährleisten. Wenn die Stifte diese Breite überschreiten, wiederholen Sie Schritt 1.2, bis die gewünschte Stiftbreite erreicht ist. Wenn sich der Blutfluss nach dem Anheften verlangsamt, wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 1.3 mit einer neuen Probe.
   3. Führen Sie den vierten Stift durch das Vesikel oticus ein, während Sie ihn leicht nach vorne drehen, während der Stift in das Vergussmittel eindringt (Abbildung 1B). Achten Sie bei einer leichten Drehung auf das Gewebe zwischen dem Cleithrum und dem Vesikel oticum, um die Ansammlung afferenter Somata freizulegen.
      Anmerkung: Das abgewinkelte Einsetzen des vierten Stifts dient dazu, die Freilegung des afferenten Ganglions der hinteren lateralen Linie sicherzustellen, das ansonsten durch das große Vesikel oticus behindert wird.

>4. Aufzeichnung von afferenten Neuronen

1. Füllen Sie die afferente Aufzeichnungselektrode mit 30 μl der extrazellulären Lösung, führen Sie sie in den Pipettenhalter des rechten Kopftisches ein (Abbildung 1B, C) und senken Sie sie in die Schalenlösung ab, während Sie einen positiven Druck (1-2 mm Hg) ausüben, der von einem pneumatischen Schallkopf erzeugt wird.
2. Lokalisieren Sie das afferente Ganglion der hinteren Seitenlinie und befestigen Sie es locker.
   1. Senken Sie mit einem Mikromanipulator die afferente Elektrodenspitze ab, bis sie sich über dem Cleithrum befindet.
   2. Erhöhen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache Eintauchen und lokalisieren Sie den Schnittpunkt zwischen dem Nervus der hinteren Seitenlinie und dem Cleithrum. Folgen Sie dem Nervus lateralis anterior vom Cleithrum bis zu der Stelle, an der die Fasern das afferente Ganglion der hinteren lateralen Linie innervieren, erkennbar durch den diskreten Cluster von Soma (Abbildung 1F).
   3. Führe die Elektrodenspitze über das Ganglion afferent und senke die Pipette ab, bis die Spitze das Epithel berührt. Manövrieren Sie die Elektrode vorsichtig so, dass der gesamte Spitzenumfang das afferente Ganglion berührt.
   4. Mit dem pneumatischen Messumformer Unterdruck (20-50 mm Hg) anlegen und halten.
      Anmerkung: Der Unterdruck, der auf das afferente Ganglion ausgeübt wird, ist sanft. Ein erhöhter Unterdruck kann das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern, aber die Gesundheit der afferenten Neuronen verschlechtert sich bei anhaltender aggressiver Absaugung, was die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Aufzeichnung verringert.
3. Zeichnen Sie die afferente Neuronenaktivität auf.
   1. Der linke Kopftisch sollte mit dem Verstärker verbunden sein, der das verstärkte Signal an einen Digitizer weiterleitet, der das besagte Signal an die Elektrophysiologie-Software der Patch-Clamp ausgibt, die auf einem benachbarten Computer überwacht werden soll.
   2. Klicken Sie in pClamp10 auf die Schaltfläche Wiedergabe in der Symbolleiste, um afferente Neuronen zu überwachen.
   3. Stellen Sie sicher, dass die Aufzeichnung afferenter Neuronen in der gesamten Zelle und mit losen Pflastern erreicht wird, sobald Spikes spontan auftreten, etwa alle 100-200 ms (Abbildung 1E).
   4. Erhöhen Sie allmählich den Elektrodendruck des afferenten Neurons wieder auf atmosphärisch (0 mm Hg) und halten Sie ihn für den Rest der Aufnahme.

Ergebnisse

Abbildung 1: Gleichzeitige elektrophysiologische Aufzeichnung der Aktivität des afferenten Neurons der hinteren Seitenlinie und der ventralen motorischen Wurzel. (A). Beispiel für eine Aufzeichnungselektrode mit Loose-Patch-Afferent (i) und einer ventralen motorischen Wurzel (ii). Die Maßstabsbalken stellen 50 μm dar. (B) Zebrafis...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
100 mL Becherglas	Pyrex	1000	Gefäß für Ätzmittel
10x Wasser-Immersionsobjektiv	Olymp	UMPLFLN10xW	Geringe Vergrößerung zur Positionierung der Larven und zur Aufnahme der Elektrode
40x Wasser-Immersionsobjektiv	Olymp	LUMPLFLN40XW	Höhere Vergrößerung für die Positionselektrodenspitze und die Einrichtung einer Patch-Klemme
BNC-Koaxialkabel	ThorLabs (Englisch)	Artikel-Nr.: 2249-C-12	Anschluss von Verstärker- und Digitizer-Kanälen; 4 erforderlich
Kapillaren aus Borosilikatglas mit Filament	Warner Instruments	G150F-3	Innendurchmesser: 0,86, Außendurchmesser: 1,50; Kapillarglas zur Bildung von Aufzeichnungselektroden
Computer	N/A	N/A	Jeder Computer sollte funktionieren
DC-Stromversorgung	Tenma	Tel.: 72-420	Wird zum elektrischen Ätzen von Präparierstiften verwendet
Digitalisierer für Elektrophysiologie	Axon Instrumente, Molekulare Bauelemente	Axon DigiData 1440A	Ermöglicht die Erfassung von Patch-Clamp-Daten
Faden	Sutter Instrument Unternehmen	FB255B	2,5 mm Box-Filament für Mikropipettenabzieher
Feine Pinzette	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Dumont #5 (0,05 x 0,02 mm) Artikel Nr. 11295-10	Wird verwendet, um Larven zu manipulieren und Stecknadeln einzuführen
DIC-Mikroskop mit festem Tisch	Olymp	BX51WI	Mikroskop zur Visualisierung und Erstellung von Patch-Clamp-Aufnahmen
Flexible, konische Pipettenspitze	Fisher Scientific	Tel.: 02-707-169	Flexible Spitzen ermöglichen das Einführen in die Aufzeichnungselektrode, um extrazelluläre Lösung an der Spitze abzugeben
FluoroSchale	World Precision Instruments Inc.	Nr. FD3510-100	Abdeckung Schüssel mit Glasboden Aufnahmeschale
KimWipe (Englisch)	KimTech	Artikel-Nr.: 34155	Task Wipe zum Ableiten von überschüssiger Flüssigkeit von Larven
Kwik-Gard	World Precision Instruments Inc.	710172	Selbstmischendes Sylgard-Elastomer
Mikroelektroden-Verstärker	Axon Instrumente, Molekulare Bauelemente	MultiClamp 700B	Patch-Clamp-Verstärker für Zweikanal-Aufnahmen
Mikroschmiede	Narishige	MF-830 Mikroschmiede	So polieren Sie die Aufnahmeelektrode
Steuereinheit für Mikromanipulatoren	Siskiyou	MC1000-eR/T	4-Achsen-Drehregler-Koordinator zur Steuerung des Mikromanipulators
Abzieher für Mikropipetten	Sutter Instrument Unternehmen	Flammend/Braun P-97	Zum Einziehen von Kapillarglas in Aufzeichnungselektroden
Mikroskop-Steuereinheit	Siskiyou	MC1000e	Positionierung des Mikroskops um den festen Tisch und Vorbereitung
Motorisierter Mikromanipulator	Siskiyou	MX7600	Positioniert den Kopftisch und die angebrachte Aufnahmeelektrode für die Patch-Clamp-Aufnahme
MultiClamp Kommandant	Molekulare Bauelemente	2.2.2	Herunterladbar von der Download-Seite für Axon MultiClamp 700B Commander
Optischer Lufttisch	Newport Corporation	VH3036W-OPT	Breadboard-Isolationstisch zum Schwimmen des Mikroskops und zur Minimierung von Vibrationen während der Aufnahme
pCLAMP	Molekulare Bauelemente	10.7.0	Herunterladbar von Axon pCLAMP 10 Software zur Erfassung und Analyse von Elektrophysiologie-Datenerfassung und -analyse auf der Download-Seite
Petrischale	Falke	35-3001	Wird verwendet, um Larven in Lähmungsmittel zu tauchen
Pipettenhalter	Molekulare Bauelemente	1-HL-U	Halten Sie die Aufnahmeelektrode fest und verbinden Sie sie mit dem Kopftisch
Pneumatischer Wandler	Biomedizinische Instrumente von Fluke	DPM1B	Zur Steuerung des Innendrucks der Aufzeichnungselektrode
Kaliumhydroxid	Sigma-Aldrich	221473-25G	Ätzmittel zum Ätzen von Präparierstiften
Silikon-Schlauch	Tygon	14-169-1A	Schlauch zum Verbinden des pneumatischen Wandlers mit dem Pipettenhalter
stereomikroskop	Carl Zeiss	Stemi 2000-C	Wird zur Visualisierung von Stecknadelspitzen und bei der Vorbereitung von Larven verwendet
Rasierklinge mit gerader Kante	Canopus	Bestellen Sie bei amazon.com	Schneidet den Wolframdraht ab, während er Sezierstifte herstellt
Spritze	Becton Dickinson Compoany	309602	Gefüllt mit extrazellulärer Lösung zur Injektion in Aufzeichnungselektroden
Pipette übertragen	Sigma-Aldrich	Z135003-500EA	Unsterile Einwegpipette zum Übertragen von Larven
Tricain-Methansulfonat	Syndel	Artikel-Nr.: 12854	Pharmazeutisches Aneasthetikum, das zur Einschläferung von Larven mit hoher Dosierung verwendet wird.
Wolframdraht	World Precision Instruments Inc.	Artikel-Nr.: 715500	0,002 Zoll, 50,8 μm Durchmesser; wird zur Herstellung von Sezierstiften verwendet
Vakuum-Filtrationsanlage	Sigma-Aldrich	SCGVU11RE	Sterile Einweg-Vakuumfiltrationseinheiten zur Sterilisation extrazellulärer Lösungen, die für elektrophysiologische Elektrodenringer verwendet
Spannungs-Zange Strom-Zange Kopftisch	Molekulare Bauelemente	CV-7B	Lieferung mit MultiClamp 700B-Verstärker, der als linker und rechter Kopftisch verwendet wird
α-Bungarotoxin	ThermoFisher	Nr. B1601	Zur Immobilisierung der Larven vor der Aufnahme

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