$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung von akuten Hippocampus-Hirnschnitten
- Herstellung von Scheibenlösungen
- Bereiten Sie 500 mL Saccharose-Schneidlösung vor, bestehend aus: 194 mM Saccharose, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-Glucose, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4 und 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, gesättigt mit 95 % O2 und 5 % CO2.
- Bereiten Sie 1-2 Liter Aufzeichnungslösung (künstliche Zerebrospinalflüssigkeit, ACSF) vor, bestehend aus: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-Glucose, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4 und 26 mM NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 (nach dem Blasen), 290 - 300 mOsm, gesättigt mit 95 % O2 und 5 % CO2. Füllen Sie ein Becherglas mit einer Halterkammer für Gehirnscheiben mit Aufnahmelösung und halten Sie es auf 32-34 °C. Füllen Sie die Vibratomkammer mit Eiswassermatsch.
- Akute Schnittvorbereitung
- Betäuben Sie eine Maus tief, indem Sie sie in eine mit 2-3 ml Isofluran vorgeladene Glasglocke legen. Prüfen Sie, ob der Zehenkneifreflex nicht reagiert, und wenn er nicht reagiert, enthaupten Sie ihn schnell mit einer scharfen Schere oder Guillotine, wie es Ihr Tierprotokoll erfordert.
- Machen Sie einen 2-3 cm langen Schnitt mit einer Schere aus dem kaudalen Teil des Schädels, um die Kopfhaut entlang der Mittellinie zu durchtrennen. Während Sie die Kopfhaut manuell zurückziehen, machen Sie zwei 1 cm lange horizontale Schnitte aus dem Foramen magnum entlang der Seiten des Schädels. Schneiden Sie dann mit einer feinen Schere einen Schnitt über die gesamte Länge des Schädels, entlang der Mittellinie von der Rückseite des Schädels bis zur Nase.
- Mit einer feinen Pinzette, die in der Nähe der Mittellinie eingeführt wird, ziehen Sie den eingeschnittenen Schädel in zwei Teile zurück. Entnehmen Sie das Gehirn der Maus aus dem Schädel und entfernen Sie mit einer Klinge das Kleinhirn und die Riechkolben, die sich jeweils im kaudalen und rostralen Teil des Gehirns befinden. Diese sind an den großen Fissuren zu erkennen, die sie von der Hirnrinde trennen.
- Montieren Sie den Gehirnblock mit Sekundenkleber auf die Vibratogramm-Schale. Füllen Sie die Vibratomus-Schale mit eiskalter Schneidlösung.
- Schneiden Sie Gewebeschnitte auf der koronalen Ebene bei einer Dicke von 300 μm. In der Regel können 6 koronale Hippocampus-Schnitte entnommen werden.
- Nachdem jeder Abschnitt geschnitten wurde, geben Sie die Scheiben sofort in die Scheibe mit dem auf 32-34 °C erwärmten Becherglas. Halten Sie die Schnitte 20 Minuten lang auf dieser Temperatur, bevor Sie den Becher mit den Schnitten entfernen und diesen vor der Aufnahme mindestens 20-30 Minuten bei Raumtemperatur aufbewahren.
>2. Messung der elektrisch evozierten K+-Dynamik
- Einrichten der Scheibenvorbereitung
- Legen Sie die Gehirnscheibe vorsichtig mit einer Pasteur-Pipette in die Badewanne und halten Sie sie vorsichtig mit einer Platinharfe mit Nylonsaiten an Ort und Stelle.
- Stellen Sie sicher, dass die Spitzen der bipolaren Stimulationselektrode parallel zueinander und auf gleicher Höhe mit der Ebene der Scheibe sind. Führen Sie die Elektroden langsam über einen Zeitraum von 6-7 Sekunden in eine Tiefe von ca. 40-50 μm in das CA3-Stratum radiatum ein, um die Schaffer-Kollateralen zu stimulieren. In koronalen Schnitten kann CA3 näherungsweise als der Teil des Hippocampus identifiziert werden, der lateral der Körnerzellschicht am Hippocampus liegt, wobei das Stratum radiatum medial und ventral zur pyramidalen Zellschicht abfällt.
- Führen Sie die K+-selektive Elektrode vorsichtig in ca. 50 μm Tiefe in das CA1-Stratum radiatum ein, indem Sie die Elektrode über ca. 3-4 Sekunden langsam absenken. Lassen Sie das Potential über die Elektrode stabilisieren, bevor Sie Stimulationen auf die Scheibe anwenden: Dies dauert in der Regel 5 bis 10 Minuten. Wenn die Scheibe spontane Veränderungen des extrazellulären K+ aufweist, verwerfen Sie diesen Vorgang und wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer neuen Schnitte.
- Messen Sie die evozierte K+-Freisetzung
- Wenden Sie elektrische Stimulationszüge (8 Impulse) an, indem Sie den Auslöser am Stimulator manuell drücken, während Sie die Reaktionen digital aufzeichnen. Wenden Sie die Stimulation bei 10 Hz und 1 ms Pulsbreite an, beginnend bei 10 μA Stimulusamplitude
.
- Wenden Sie ansteigende Stimulationsamplituden um den Faktor 2 an, bis eine maximale K+-Reaktionsamplitude erkannt wird. Wenn Sie keine Reaktion sehen, bewegen Sie die Position der K+-Elektrode in Schritten von 100 μm näher an die Stimulationsstelle
- Bestimmen Sie die Stimulusamplitude, die die halbmaximale Reaktion erzeugt. Diese liegt nach unserer Erfahrung zwischen 40-160 μA, abhängig von der Präparationsqualität, dem Alter des Tieres und dem Abstand zwischen Stimulationselektroden und K+ selektiver Elektrode.
- Wenn in derselben Schicht eine Stimulusamplitude verwendet wird, die eine Stufe niedriger ist als die Amplitude, die die halbmaximale Reaktion erzeugt (z. B. wenn 80 μA eine halbmaximale Reaktion erzeugt, verwenden Sie 40 μA), wenden Sie Stimuluszüge mit zunehmender Anzahl von Impulsen an. Anfangs haben wir Züge mit 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 und 128 Impulsen verwendet.
- Um zu bestätigen, dass K+-Signale durch das Auslösen des Aktionspotentials des elektrisch stimulierten Schaffer-Kollateralbades vermittelt werden, wenden Sie 0,5 μM Tetrodotoxin (TTX) in ACSF für 10 Minuten an und wiederholen Sie das Stimulationsprotokoll. Es sollten keine evozierten Reaktionen beobachtet werden.
- Bestätigen Sie nach Abschluss des Schichtexperiments, dass die Elektrode ihre Empfindlichkeit beibehalten hat, indem Sie die Elektrode in den Kalibrierlösungen neu kalibrieren und sicherstellen, dass die Reaktion nicht um mehr als 10 % von der ursprünglichen Kalibrierung abgewichen ist