$$\rightleftharpoonup{xx}$$
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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
HINWEIS: Aufnahmen von Q175-Wildtyp- (WT) und Heterozygoten (HETs) können in jedem Alter und Geschlecht durchgeführt werden. Hier untersuchten wir Männer und Frauen im Alter von 51 bis 76 Wochen.
>1. Injektion des Glutamat-Sensors iGluu zur Expression in kortikostriatalen Axonen
- Verwenden Sie den Pipettenabzieher (Ein-Schritt-Modus), um Pipetten aus Borosilikatglas für die Injektion des Virus vorzubereiten. Brechen Sie die Pipette nach dem Ziehen manuell, um einen Spitzendurchmesser von 30–50 μm zu erhalten. Autoklavieren Sie die Pipette und die chirurgischen Instrumente, einschließlich des Bohrers zum Öffnen des Schädels.
- Lagern Sie den Virus AAV9-CaMKIIa.iGluu. WPRE-hGH (7,5 x 1013gc/mL) bei -80 °C in 10 μL Aliquoten. Wenn die Injektionen kurz nach der Virusproduktion (innerhalb von 6 Monaten) durchgeführt werden, halten Sie sie bei 5 °C. Nehmen Sie vor der Operation das Fläschchen heraus und halten Sie es bei Raumtemperatur.
- Füllen Sie die Glaspipette und entfernen Sie alle Blasen.
- Betäuben Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer Lösung, die 87,5 mg/kg Ketamin und 12,5 mg/kg Xylazin enthält. Injizieren Sie subkutan 0,25 % Bupivacain (8 mg/kg) zur zusätzlichen Schmerzlinderung. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie den Muskeltonus überwachen und das Fehlen von schmerzinduzierten Reflexen beobachten.
- Rasieren Sie die Haut am Kopf und sterilisieren Sie sie mit 70% Alkohol. Passen Sie die Maus in den stereotaktischen Rahmen ein.
- Verwenden Sie ein Skalpell, um die Haut zu entfernen, und einen Hochgeschwindigkeitsbohrer (38.000 U/min), um ein 1,2 mm großes Loch in den Knochen über dem motorischen Kortex zu bohren.
- Montieren Sie die Spritze mit der beigefügten Injektionspipette in der Halterung eines Präzisionsmanipulators. Führen Sie die vertikal ausgerichtete Pipette an 4 verschiedenen Stellen in den Kortex ein. Die Injektionskoordinaten sind, bezogen auf das Bregma (in mm): anterior 1,5, lateral 1,56, 1,8, 2,04, 2,28. Die Tiefe bezogen auf die Dura mater beträgt (in mm): 1,5–1,7.
- Mit dem Injektionssystem werden 0,3 μl pro Stelle der unverdünnten Viruslösung mit einer Geschwindigkeit von 0,05 μl/min injiziert. Lassen Sie die Pipette nach jeder Injektion 1 Minute lang an Ort und Stelle, bevor Sie sie langsam (1 mm/min) zurückziehen.
- Zum Schluss verschließen Sie die Operationswunde mit einer Nylonnaht.
- Lassen Sie die Maus 0,5 bis 1 Stunde auf einem Heizkissen in einem sauberen Käfig stehen, bevor Sie sie wieder in ihren ursprünglichen Käfig stellen.
- Halten Sie die Maus 6 bis 8 Wochen lang in einem 12-stündigen Tag-Nacht-Zyklus, bevor Sie akute Hirnschnitte vorbereiten.
Anmerkung: Um Immunreaktionen zu vermeiden, die zu Zellschäden und Synapsenverlust führen, muss die Injektion mehrerer viraler Konstrukte gleichzeitig oder innerhalb von 2-3 Stunden nach der primären Injektion durchgeführt werden. Die Koordinaten für die iGluu-Injektion wurden gemäß dem Paxinos- und Franklin-Gehirnatlas ausgewählt. Sie entsprechen dem motorischen Kortex M1. Die Immunfärbung von injizierten Gehirnen machte zahlreiche, aber meist gut isolierte Axone und Axonvarizen im ipsi- und kontralateralen Striatum sowie in den kontralateralen M1- und S1-Kortikalen sichtbar.
>2. Suche nach glutamatergen Anschlüssen, die den Glutamatsensor iGluu exprimieren
- Kalibriermodus
- Bereiten Sie die sCMOS-Kamera und die Kamerasteuerungssoftware mit den folgenden Einstellungen vor. Stellen Sie auf der Ausleseseite die Pixelausleserate ein: 560 MHz (= schnellste Auslesung), Empfindlichkeit/Dynamikbereich: Bit, Störrauschfilter: Ja, Überlappungsanzeige: Ja. Wählen Sie auf der Seite Binning/ROI die Option Vollbild aus.
- Bereiten Sie einen Objektträger vor, der einen Tropfen von 5 mg/ml Luzifergelb (LY) unter einem Deckglas enthält.
- Platzieren Sie den LY-Slide unter einem 63-fach-Objektiv, öffnen Sie den Lasershutter und führen Sie eine Serienaufnahme mit den folgenden Einstellungen durch: Pixel Binning: 1x1, Trigger-Modus: Intern, Belichtungszeit: Minimal (noch festzulegen).
- Passen Sie die Laserleistung so an, dass ein Fluoreszenzfleck mit einem Durchmesser von 4 μm erzeugt wird (das Bild sollte keine gesättigten Pixel enthalten).
- Um eine Kalibrierung des Laserpositioniersystems durchzuführen, wählen Sie die folgenden Einstellungen in der Laserpositioniersoftware: Spotgrößendurchmesser: 10, Abtastgeschwindigkeit: 43.200 kHz. Klicken Sie auf die Schaltfläche Bildaufnahme starten im rechten Bereich. Legen Sie Ausführungen: 0, Ausführungsverzögerung: 0 fest, und wählen Sie auf der Seite Sequenz die Option Bei Gültigkeitsdauer ausführen aus. Klicken Sie auf der Seite Kalibrierung auf die Schaltfläche Kalibrieren und kalibrieren Sie die Lasersteuerungssoftware gemäß den Anweisungen in der oberen linken Ecke des Erfassungsbildschirms.
- Wenn das Setup eine unabhängige Software für die Kamera- und Lasersteuerung verwendet, erfassen Sie Screenshots aus dem Kameraerfassungsfenster und senden Sie sie an die Lasersteuerungssoftware, um die XY-Koordinaten neu zu berechnen. Wenn die Software auf verschiedenen Computern installiert ist, verwenden Sie einen Videograbber, um das Bild in die Lasersteuerungssoftware zu importieren. Die Lasersteuerungssoftware benötigt die Informationen über die XY-Skalierungsfaktoren und Offsets. Bestimmen Sie dazu die Koordinaten der oberen linken, unteren linken und unteren rechten Ecken des Bildes innerhalb des Erfassungsfensters des Lasersteuerungsprogramms. Berechnen Sie die Skalierungsfaktoren nach folgenden Gleichungen: X-Faktor = (X unten-rechts – X unten-links)/2048, X-Offset = X unten-links, Y-Faktor = (Y oben-links – Y unten-links)/2048, Y-Offset = Y unten-links.
- Erstellen Sie am Ende des Kalibrierungsvorgangs einen rechteckigen Bereich of Interest (ROI) von 267 x 460 Pixeln, verschieben Sie ihn in die Mitte des Bildschirms und klicken Sie auf die Schaltfläche Sequenz starten.
- Kehren Sie zu den folgenden Einstellungen der Kamerasteuerungssoftware zurück: Binning: 2x2, Auslösemodus: Externe Belichtung, Belichtungszeit: Minimal (noch festzulegen).
- Autofluoreszenz-Korrekturmodus
HINWEIS: Das Ruheniveau von [Glu] in der Umgebung aktiver synaptischer Terminals liegt typischerweise unter 100 nM. Dementsprechend wird jeder Sensor für Glutamat, insbesondere ein Sensor mit niedriger Affinität wie iGluu, ohne synaptische Glutamatfreisetzung eher schwach sein. Dennoch kann eine gewisse iGluu-Fluoreszenz auch in Ruhe nachgewiesen werden, muss aber von der Gewebeautofluoreszenz unterschieden werden. Die 473-nm-Beleuchtung löst sowohl iGluu-Fluoreszenz als auch Autofluoreszenz aus (Abbildung 1A–C). Letzteres nimmt einen weiten Wellenlängenbereich ein, während die Fluoreszenz von iGluu auf 480–580 nm (mit einem Maximum bei 510 nm) begrenzt ist. Die Korrektur für die Autofluoreszenz basiert auf der Aufnahme von zwei Bildern mit unterschiedlichen Hochpassfiltern.
- Bereiten Sie Gehirnschnitte im Voraus vor, wie an anderer Stelle beschrieben. Kleiescheiben bereithalten.
- Übertragen Sie die Scheiben in die Aufnahmekammer und tauchen Sie sie in sauerstoffhaltige künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF), die 125 mM Natriumchlorid (NaCl), 3 mM Kaliumchlorid (KCl), 1,25 mM Di Natriumwasserstoff (NaH2PO4), 25 mM Natriumbikarbonat (NaHCO3), 2 mM Calciumchlorid (CaCl2), 1 mM Magnesiumchlorid (MgCl2) enthält), 10 mM Glukose (pH 7,3, 303 mOsm/L), ergänzt mit 0,5 mM Natriumpyruvat, 2,8 mM Natriumascorbat und 0,005 mM Glutathion. Verwenden Sie eine Flussrate von 1–2 mL/min. Halten Sie die Badtemperatur bei 28–30 °C.
- Lokalisieren Sie das dorsale Striatum unter einem 20-fachen Wasserimmersionsobjektiv. Fixieren Sie die Scheiben mit einem Nylongitter auf einer Platinharfe, um die Gewebebewegung zu minimieren. Wechseln Sie zum Wasserimmersionsobjektiv 63x /NA 1.0. Wählen Sie Filter aus, die Licht bei 473 nm reflektieren (dichroitischer Spiegel) und Licht mit Wellenlängen >510 nm (Emissionsfilter) durchlassen.
- Synchronisieren Sie Beleuchtung, Stimulation und Bildaufnahme über eine Analog-Digital-Karte (AD)/Digital-Analog-Karte (DA) (AD/DA) mit der jeweiligen Steuerungssoftware. Stellen Sie das Triggerprogramm so ein, dass die Erfassung mit einer Laserbelichtungszeit von 180 ms und einer Bildaufnahmezeit von 160 ms gesteuert wird. Verwenden Sie das Laserpositioniergerät, um den Laserstrahl an eine vorgegebene Anzahl von Punkten zu senden, und legen Sie die Einstellungen für die Scangeschwindigkeit und die Spotgröße fest.
- Erfassen Sie ein Bild sowohl von Autofluoreszenz- als auch von iGluu-positiven Strukturen mit einem Hochpassfilter bei 510 nm ("gelbes Bild").
- Nehmen Sie ein Bild mit reiner Autofluoreszenz mit einem Hochpassfilter bei 600 nm auf ("rotes Bild").
- Skalieren Sie die roten und gelben Bilder, indem Sie die mittlere Intensität der 10 hellsten und der 10 dunkelsten Pixel verwenden, um den Bereich zu definieren. Führen Sie eine Subtraktion "gelbes minus rotes Bild" durch und skalieren Sie das subtrahierte Bild neu, um eine standardmäßige 8-Bit-TIF-Datei zur bequemen Visualisierung des interessierenden Bouton zu generieren (Abbildung 1D). Es enthält die hellen Pixel aus den iGluu-positiven Strukturen, graue Pixel aus dem Hintergrund und dunkle Pixel aus Strukturen mit Autofluoreszenz.
Anmerkung: Mit der gegebenen Ausrüstung liegt die mittlere Ruhefluoreszenz (F) unter 700 A.U.
- Bouton-Suchmodus
HINWEIS: iGluu-positive Pixel können zu funktionell unterschiedlichen Elementen des Axonbaums gehören, wie z. B. Axonästen unterschiedlicher Ordnung, Bifurkationsstellen, Varizen nach Vesikeldepletion oder voll aktive Varizen. Es ist jedoch fast unmöglich, funktionelle synaptische Terminals allein durch visuelle Inspektion zu identifizieren. Daher muss jedes glutamaterge synaptische Terminal durch seine Reaktionsfähigkeit auf elektrische Depolarisation identifiziert werden. Stellen, die nicht auf Stimulation reagieren, müssen verworfen werden. Das physiologische Mittel, um die Freisetzung von Glutamat aus kortikostriatalen Axonen zu induzieren, besteht darin, ein Aktionspotential hervorzurufen. Dies kann entweder durch die Verwendung eines Kanalrhodopsins mit geeigneten spektralen Eigenschaften oder durch elektrische Stimulation eines Axons erreicht werden, das durch iGluu selbst sichtbar gemacht wird. Um eine versehentliche Aktivierung von Opsin zu vermeiden, haben wir den letzteren Approastep bevorzugt
- Verwenden Sie den Mikropipettenabzieher (in einem Vier-Stufen-Modus), um Stimulationspipetten aus Borosilikatglaskapillaren herzustellen. Der innere Spitzendurchmesser sollte ca. 1 μm betragen. Wenn er mit ACSF gefüllt ist, sollte der Elektrodenwiderstand etwa 10 MΩ betragen.
- Um die wirkungspotentialabhängige Freisetzung von Glutamat aus einem Satz synaptischer Boutons, die an dasselbe Axon gebunden sind, zu induzieren, verwenden Sie eine 63-fache Vergrößerung, den 510-nm-Emissionsfilter und das subtrahierte Bild, um eine Glasstimulationselektrode neben einer fluoreszierenden Krampfadern zu platzieren. Vermeiden Sie die Nähe zusätzlicher Axone.
- Schalten Sie den Stimulator ein, um depolarisierende Stromimpulse an die Stimulationspipette abzugeben. Verwenden Sie Stromstärken um 2 μA (nicht mehr als 10 μA).
- Schalten Sie das Mehrkanal-Badapplikationssystem ein, bei dem ein Kanal die Standardbadlösung und die anderen Kanäle die notwendigen Blocker von Ionenkanälen, Transportern oder Membranrezeptoren liefern. Steuern Sie den Durchfluss an der Aufzeichnungsstelle und wechseln Sie dann zum Tetrodotoxin (TTX)-Kanal (Badlösung plus 1 μM TTX). Nach 2-3 Minuten stimulieren Sie den interessierenden Bouton erneut, aber jetzt ohne Generierung von Handlungspotenzial. Die Freisetzung erfolgt direkt durch den Kalziumeintrag durch spannungsabhängige Kalziumkanäle
.
- Durch Drehen der Intensitätstaste am Stimulator können Sie den Stimulationsstrom so einstellen, dass Sie Reaktionen erhalten, die denen ähneln, die über Aktionspotentiale hervorgerufen werden. Typischerweise liegt der Reizstrom bei etwa 6 μA bei einer Depolarisation von 0,5 ms.
- Zur grundlegenden Prüfung des Präparats werden 0,5 mM CdCl2 aufgetragen. Das Vorhandensein dieses Kalziumkanalblockers, der Glutamatfreisetzung, verhindert die synaptische Glutamatfreisetzung vollständig, wodurch die Kalziumabhängigkeit des direkt evozierten Glutamatsignals bestätigt wird.
Anmerkung: Die folgende allgemeine Empfehlung kann helfen, die Erfolgsrate von Einzelsynapsenexperimenten im Striatum zu erhöhen. Zur Auswahl glutamaterger synaptischer Terminals mit intakter Freisetzungsmaschinerie sollte eine Varikosität: (i) eine glatte spindelartige Form haben; (ii) nicht mit einer Axongabelung assoziiert sein; (iii) heller sein als andere Strukturen auf dem "gelben Bild"; (iv) sich im striatalen Neuropil und nicht in den Faserbahnen befinden; (v) sich auf einem sehr dünnen Axonast befinden; (vi) Sie dürfen sich nicht in den tieferen Teilen der Scheibe befinden.
>3. Visualisierung der Glutamatfreisetzung und -clearance
- Aufnahmemodus
HINWEIS: Nach der Subtraktion der Autofluoreszenz (Schritt 2.2) und einigen ersten Tests auf Reaktionsfähigkeit des interessierenden Boutons (Schritt 2.3) kann mit der Datenerfassung begonnen werden. Die Reaktionen auf die elektrische Aktivierung der Glutamatfreisetzung von einzelnen Axonterminals können direkt im Bild beobachtet werden (Abbildung 2), ohne dass weitere Analysewerkzeuge angewendet werden müssen. Es erwies sich jedoch als sehr praktisch, sofort einige grundlegende Indikatoren für die Synapsenleistung zu extrahieren (Abbildung 3). Diese Informationen werden benötigt, um Entscheidungen über den nachfolgenden Versuchsverlauf zu treffen, wie z.B. die Auswahl bestimmter terminaler Typen, die schnelle Beurteilung von HD-bedingten Veränderungen, die Anzahl und Häufigkeit von Versuchen oder Medikamenten, die mit dem Superfusionssystem angewendet werden sollen. Es kann auch notwendig sein, sich mit eventuell auftauchenden Artefakten auseinanderzusetzen. Zunächst werden die Standardeinstellungen für die Datenaufzeichnung beschrieben.
- Platzieren Sie den getesteten iGluu-positiven Bouton mit den XY-Antrieben des Mikroskops in der Nähe der Gesichtsfeldmitte. Stoppen Sie die Bildaufnahme mit der Schaltfläche Aufnahme abbrechen. Bestimmen Sie auf dem zuletzt aufgenommenen Bild die XY-Position des ruhenden Bouton-Mittelpunkts, indem Sie mit der linken Maustaste darauf klicken. Die XY-Koordinaten des eingestellten Cursors werden im unteren Statusfenster des Erfassungsfensters angezeigt.
- Berechnen Sie anhand der Kalibrierdaten (Schritt 2.1.6) die Koordinaten der Stelle, an die der Laserstrahl für die Anregung der iGluu-Fluoreszenz gesendet werden soll. Verwenden Sie die folgenden Gleichungen: X-Laser = X-Kamera * X-Faktor + X-Offset, Y-Laser = Y-Offset – Y-Kamera * Y-Faktor. Achten Sie bei dieser Neuberechnung auf die vertikalen oder horizontalen Flip-Einstellungen der Kamera.
- Erstellen Sie in der Lasersteuerungssoftware eine Ein-Punkt-Sequenz mit den berechneten Koordinaten. Wählen Sie dazu in der Lasersteuerungssoftware auf der Seite Sequenz im Feld Zur Sequenz hinzufügen die Option Punkt. Wählen Sie 10 μs für die Verzögerung bis zum Auslösen des Beginns und 180 ms für die Laserpulszeit. Bewegen Sie die Maus auf die berechneten Koordinaten und klicken Sie auf die linke Taste.
- Wählen Sie in der Lasersteuerungssoftware die folgenden Einstellungen aus: Läufe: 0, Laufverzögerung: 0, Sequenz: Bei TTL ausführen. Klicken Sie dann auf Sequenz starten.
- Wählen Sie in der Kamerasteuerungssoftware die folgenden Einstellungen aus: Stellen Sie auf der Seite Binning/ROI den Bildbereich ein: Benutzerdefiniert, Pixel-Binning: 2x2, Höhe: 20, Breite: 20, Links: X-Koordinate des ruhenden iGluu-positiven Spots minus 10 px, Unten: Y-Koordinate des ruhenden iGluu-positiven Spots minus 10 px, Aufnahmemodus: Kinetische Serie, Länge der kinetischen Serie: 400, Belichtungszeit: 0,0003744s (minimaler Wert). Mit solchen Einstellungen beträgt die Erfassungsrate 2,48 kHz.
- Wählen Sie Trigger-Modus: Extern. Klicken Sie in der Kamerasteuerungssoftware auf Signal nehmen. Initiieren Sie das für die Auslösevorrichtung festgelegte Versuchsprotokoll.
- Implementieren Sie das Versuchsprotokoll mit folgender Zeitachse: 0 ms – Versuch starten, 1 ms – Laserbeleuchtung starten, 20 ms – Bildaufnahme mit Kamera starten, 70 ms – Elektrostimulation 1 starten, 120 – Elektrostimulation 2 starten, 181 ms – Versuch beenden (Laser und Kamera aus). So erfasst die Kamera in einem Versuch 400 Bilder mit einer Frequenz von 2,48 kHz. Siehe Schritte 2.3.3 und 2.3.5. für Details zur Elektrostimulation.
- Um eine ausreichende Rückgewinnung präsynaptischer Vesikelpools zu ermöglichen, wenden Sie das Protokoll Trial mit einer Wiederholungsfrequenz von 0,1 Hz oder niedriger an.
- Offline-Konstruktion des Glutamat-Transienten und schnelle Beurteilung der Glutamatfreisetzung und -clearance zur Identifizierung pathologischer Synapsen
- Aktivieren Sie die Auswertungsroutinen. Hier verwenden wir eine hauseigene Software, SynBout v. 3.2. (Autor: Anton Dvorzhak). Die folgenden Schritte sind erforderlich, um einen ΔF/F-Transienten aus den Pixeln mit erhöhter iGluu-Fluoreszenz zu konstruieren, wie im Video in Abbildung 2 zu sehen ist.
- Um die Bouton-Größe zu bestimmen, berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) der ROI-Fluoreszenzintensität in Ruhe (F) vor Beginn der Stimulation. Bestimmen und schachteln Sie den von Pixeln eingenommenen Bereich mit F>Mittelwert + 3 SD (Abbildung 3A). Bestimmen Sie einen virtuellen Durchmesser (in μm) unter der Annahme einer kreisförmigen Form des Bereichs über dem Schwellenwert.
- Bestimmen Sie ΔF als Differenz zwischen dem Spitzenintensitätswert und F. Tragen Sie den Reizstrom und ΔF/F über die Zeit auf (Abbildung 3B). Berechnen Sie die SD von ΔF/F in Ruhe (vor Beginn der Stimulation) und die "Spitzenamplitude". Verwenden Sie Pixel mit einer Spitzenamplitude von mehr als 3 SD von ΔF/F, um eine monoexponentielle Anpassung an den Abfall vom Peak durchzuführen. Bestimmen Sie die Zeitkonstante des Zerfalls TauD von ΔF/F.
- Um die "Maximale Amplitude" bei einer bestimmten Synapse zu schätzen, wählen Sie das Pixel mit dem höchsten ΔF/F-Wert aus. Es befindet sich typischerweise innerhalb oder neben den Grenzen des ruhenden Boutons iGluu Fluoreszenz. Die "maximale Amplitude" wäre der beste Indikator für die Glutamatbelastung, die der Clearance-Maschinerie einer einzelnen Synapse ausgesetzt ist.
