Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Chirurgie
- Verwenden Sie für elektrophysiologische Aufzeichnungen Urethan (VORSICHT) für die Anästhesie.
Achtung: Urethan ist giftig und krebserregend, halten Sie sich daher immer an die Sicherheitsvorschriften und das Datenblatt des Stoffherstellers.
- Bereiten Sie eine Lösung von 200 mg/ml Urethan in 0,9 % Natriumchlorid (NaCl) medizinischer Kochsalzlösung vor.
- Verabreichen Sie insgesamt 1,3 g/kg Körpergewicht Urethan intraperitoneal (IP). Abhängig vom Rattenstamm kann es sinnvoll sein, die Dosis in zwei Dosen mit einem Abstand von 15 Minuten zwischen den Injektionen aufzuteilen, um die Sicherheit der Anästhesie zu erhöhen.
- Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie mit Hilfe des Pedalzurückzugsreflexes und anderer geeigneter Reflexe. Wenn die Anästhesie nicht tief genug ist, um eine Operation durchzuführen, injizieren Sie 0,15 g/kg Körpergewicht IP und warten Sie weitere 15 Minuten.
- Tragen Sie eine Augensalbe auf, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern.
- Überwachen Sie ständig die Atemfrequenz und den Pedalrückzugsreflex während der Anästhesie. Verwenden Sie ein Kleintier-Heizkissen mit Temperaturregelung, um sicherzustellen, dass während der gesamten Operation eine physiologische Körpertemperatur aufrechterhalten wird. Wechseln Sie vor Beginn der elektrophysiologischen Aufzeichnungen zu einer nicht-elektrischen Alternative (z.B. Natriumacetat-Kopfpolster).
- Rasieren Sie das Fell entlang der Rückenseite des Kopfes, um ein sauberes Operationsfeld zu erhalten. Desinfizieren Sie die Inzisionsstelle mit einem geeigneten chirurgischen Desinfektionsmittel. Fixieren Sie das Tier im stereotaktischen Rahmen.
- Führen Sie mit einem Skalpell einen 2 cm langen Schnitt der Kopfhaut in sagittaler Richtung durch. Kratzen Sie mit einem Skalpell die Schädelaponeurose leicht ab und desinfizieren Sie den Schädel. Verwenden Sie Wattestäbchen, die in 3 % Wasserstoffperoxid (H2O2) getränkt sind, um restliches Gewebe zu entfernen.
- Verwenden Sie bei Bedarf einen Elektrokauter oder Thermokauter, um die Blutung zu kontrollieren. Stoppen Sie Blutungen aus dem Schädelknochen und der Unterhaut, wenn die Blutung nach 1-2 min nicht spontan aufhört und die Sicht auf den Schädel behindert.
- Passen Sie den Schneidezahn so lange an, bis sich der Kopf in flacher Schädelposition befindet, was bedeutet, dass sich Bregma und Lambda als stereotaktische Referenzpunkte in derselben Ebene befinden. Dies ist vor allem wichtig, um eine hohe chirurgische Präzision zu erreichen. Verwenden Sie ein standardmäßiges stereotaktisches Rattenausrichtungswerkzeug, kalibrieren Sie die vorgesehene Spitze unter mikroskopischer Sicht auf das Bregma und stellen Sie den Schneidezahn so ein, dass die für das Bregma und das Lambda auf dem Werkzeug vorgesehenen Punkte gleichzeitig den Schädel berühren.
HINWEIS: Ein Blick von einer Seite mit fokussiertem Licht von der anderen Seite kann helfen, diesen Zustand zu bestimmen. Alternativ können Sie einen stereotaktischen Halter mit einer feinen Kanüle nehmen und die dorsoventralen Koordinaten von Bregma und Lambda unter mikroskopischem Sehen messen. Stellen Sie den Schneidezahn so lange ein, bis die dorsoventralen Koordinaten von Bregma und Lambda gleich sind.
- Verwenden Sie einen stereotaktischen Halter mit einer Kanüle, kalibrieren Sie auf das Bregma und berechnen Sie dann die Position aller Bohrlöcher auf dem Schädel. Markieren Sie mit dem stereotaktischen Halter die Positionen der zu bohrenden Löcher entweder durch vorsichtiges Kratzen des Schädels oder durch Verwendung eines chirurgischen Farbmarkers. Die Koordinaten dafür hängen von den Zielen ab; Koordinaten mit Bezug auf das Bregma sind für den hyperdirekten Weg in Tabelle 1 angegeben, einschließlich der vorgeschlagenen Koordinaten für Kleinhirn-Referenzelektroden.
- Bohren Sie mit einem Mikrobohrer vorsichtig alle Löcher. Für den Nucleus subthalamicus (STN) und die Substantia nigra pars reticulate (SNr) bohren Sie ein gemeinsames Loch (ca. 2 mm x 3 mm groß). Alle anderen Bohrungen sollten einen Durchmesser von ca. 1 mm haben.
- Nehmen Sie zwei feine Kanülen (mindestens 27 G) und biegen Sie ihre Spitzen mit einer harten Oberfläche oder einer Pinzette zu einer hakenförmigen Form. Verwenden Sie diese, um Schmutz aus den Bohrlöchern zu entfernen, und schneiden und entfernen Sie vorsichtig die Dura Mater in das übliche STN/SNr-Loch.
- Spülen Sie die Bohrlöcher mit physiologischer Kochsalzlösung. Tragen Sie alle 15 Minuten einen Tropfen physiologische Kochsalzlösung auf die Bohrlöcher auf, um ein Austrocknen des Gehirns und der Dura zu verhindern.
- Nehmen Sie einen Mikrobohrer und eine passende Mikroschraube aus Edelstahl (z.B. eine Schraube M 1,2 mm x 2 mm), bohren Sie ein Loch und schrauben Sie eine Mikroschraube zwischen die Bohrlöcher der Referenz-Epiduralelektroden oberhalb des Kleinhirns, machen Sie dasselbe mit den M1-Epiduralelektroden.
- Schieben Sie die selbstgebauten Ag/AgCl-Epiduralelektroden in die Bohrungen für die Referenzelektroden und M1-Elektroden. Führen Sie die Elektrodenspitze mit einer feinen Pinzette und schieben Sie sie direkt unter dem Schädelknochen in das Bohrloch.
- Befestigen Sie alle Epiduralelektroden mit Zweikomponenten-Dentalacryl. Achten Sie darauf, dass Sie den Bregma-Punkt nicht abdecken und das übliche STN/SNr-Loch nicht beeinflussen.
- Setzen Sie den vorbereiteten Halter mit den Wolfram-Mikrodrahtelektroden in den stereotaktischen Rahmen ein.
- Kalibrieren Sie die ventralste Elektrode, die auf das STN abzielen soll, auf das Bregma. Stellen Sie die berechnete Position über dem üblichen STN/SNr-Loch ein und senken Sie die Elektroden unter mikroskopischem Sehen zum Gehirn ab. Stellen Sie sicher, dass die Wolfram-Mikrodrahtelektroden reibungslos im Gehirn verlaufen.
2. Elektrophysiologische Kartierung und Aufzeichnungen
HINWEIS: Für diesen Schritt ist ein Faradayscher Käfig und ein mehrkanaliges elektrophysiologisches Aufzeichnungssystem mit Aufzeichnungssoftware erforderlich, die in der Lage ist, Online-Filterung und Online-Spike-Sortierung durchzuführen. Verwenden Sie vorzugsweise ein System, das mit einem Vorverstärker arbeitet, der in der Nähe des Kopfes der Tiere positioniert ist, um elektrisches Rauschen und Artefakte auf ein absolutes Minimum zu reduzieren. Neben den Wolfram-Mikrodrahtelektroden sind mindestens eine Epidural- und eine Referenzelektrode notwendig, um Aufzeichnungen des hyperdirekten Signalwegs durchzuführen. Es wird empfohlen, Epidural- und Referenzelektroden paarweise einzuführen, ohne dass sie sich berühren, dies hilft im Falle einer Fehlfunktion und ermöglicht verschiedene Arten der Referenzierung in der Datenanalyse.
- Platzieren Sie einen beweglichen Faradayschen Käfig über dem stereotaktischen Rahmen. Wenn nur ein stationärer Faradayscher Käfig zur Verfügung steht, bewegen Sie den stereotaktischen Rahmen vorsichtig in den Faradayschen Käfig und stellen Sie sicher, dass die tiefen Hirnelektroden nicht in das Gehirn abgesenkt werden, bis sich der stereotaktische Rahmen in seiner endgültigen Position befindet.
- Verbinden Sie die Elektroden mit der Kopfstufe des elektrophysiologischen Aufbaus. Stellen Sie sicher, dass die Referenzelektroden an die entsprechenden Referenzkanäle angeschlossen sind.
- Richten Sie die Aufnahmesoftware ein: Bandpassfilter (0,05-8.000 Hz) und Verstärkung (Verstärkung 1.500-2.000x) des Rohdatensignals. Verwenden Sie einen Online-LFP- und Spike-Filter mit entsprechenden Einstellungen (Bandpassfilter 0,05-250 Hz für LFPs, Bandpassfilter 300-8.000 Hz für MUA). Verwenden Sie für alle Filter einen Butterworth-Filter.
- Richten Sie ggf. einen Spike-Schwellenwert für die Online-Spike-Sortierung ein. Die meisten Aufnahmeprogramme ermöglichen die Einrichtung eines Spike-Schwellenwerts, d. h. eines Amplitudenwerts, oberhalb dessen ein Signal von der Software als Spitze markiert wird. Dieser Schwellenwert kann entweder mathematisch als Faktor oder Standardabweichung der mittleren Amplitude des gefilterten Spike-Signals bestimmt werden, oder er kann vorzugsweise durch visuelle Inspektion von Datensegmenten <500 ms bestimmt und als Linie über dem Signalrauschen in einer grafischen Benutzeroberfläche eingerichtet werden.
HINWEIS: Die Absicht beim Einrichten eines Spike-Schwellenwerts besteht darin, Spikes zu zählen und Einheiten zu sortieren, um Informationen darüber zu erhalten, wie viele Neuronen derzeit aufgezeichnet sind und wie ihre Spikes geformt sind.
- Senken Sie die Wolfram-Mikrodrahtelektroden langsam auf 1 mm dorsal des Ziels ab, was STN für hyperdirect pathway ist. Warten Sie, bis sich das Signal bei Bedarf stabilisiert hat.
- Für das elektrophysiologische Mapping schieben Sie die Elektroden ventral in Schritten von 100 μm vor. Bewerten Sie bei jedem Schritt das Schussmuster, die Schussrate und die Form der Spikes. Vergleichen Sie diese mit den typischen Beispielen, die in Abbildung 1 aufgeführt sind. Im Allgemeinen zeigen dichte Kerne ein schnelles und kontinuierliches Spiking über mehrere dorsoventrale Stufen, während faserreiche Strukturen niedrige Feuerraten und eine weniger homogene Spike-Aktivität in nachfolgenden ventralen Schritten aufweisen.
- Stellen Sie für den hyperdirekten Signalweg sicher, dass sich die ventralste Elektrode im STN befindet.
HINWEIS: Der STN ist erreicht, wenn ein erheblicher Anstieg der MUA ventral der Zona incerta festgestellt wird. Ventral zum STN hört das Spiking fast vollständig auf, da die Elektrode die innere Kapsel erreicht hat. Wenn sich die ventralste Elektrode in STN befindet, stellt die Konfiguration der Wolfram-Mikroelektroden sicher, dass sich die hintere, zweite Elektrode in SNr befindet. Eine dorsoventrale Feinabstimmung in kleinen Schritten kann erforderlich sein, um typische MUA in STN und SNr gleichzeitig aufzuzeichnen. Beachten Sie, dass die Häufigkeit von MUA von der Anzahl der tatsächlich aufgezeichneten Neuronen und vom Niveau der Gehirnaktivierung abhängt.
- Sobald sich die Elektroden in der gewünschten Struktur befinden, richten Sie die Online-Filterung und die Spike-Sortierung ein (siehe Abbildung 2) und beginnen Sie dann mit der Aufzeichnung der Daten. Typische Beispiele für die verschiedenen kortikalen Synchronisationszustände, die in den LFP-Aufzeichnungen identifiziert werden können, sind in Abbildung 3 dargestellt.
Tabelle 1: Stereotaktische Koordinaten für die Aufzeichnung des hyperdirekten kortiko-basalen Ganglienwegs. Alle Punkte werden vom Bregma-Referenzpunkt am Schädel in mm gemessen; n.a.- Nicht zutreffend.
| Koordinaten von Bregma | STN | SNr | M1 | Referenz 1 | Referenz 2 |
| ant-posterior | -3.6 | -4.8 | +3,0 | -10.0 | -10.0 |
| medial-lateral | +2,5 | +2,5 | +3,0 | +3,0 | -3.0 |
| dorsal-ventral | -8.0 | n. a. | n. a. | n. a. | n. a. |
