Optische Aufzeichnung der neuronalen Aktivität in Hirnschnitten, die mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff gefärbt wurden

Zusammenfassung

Quelle: Tominaga, Y., et al. Optische Weitfeld-Einzelphotonenaufzeichnung in Gehirnschnitten mit spannungsempfindlichem Farbstoff. J. Vis. Exp. (2019).

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Beobachtung von Veränderungen der neuronalen Aktivität in einer Gehirnscheibe, die mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff gefärbt wurde. Der Farbstoff spiegelt Veränderungen des Membranpotentials des Neurons wider, indem er seine Fluoreszenzintensität verändert. Durch die Anwendung elektrischer Stimuli und fortschrittlicher bildgebender Verfahren ermöglicht dieses Verfahren die visuelle Verfolgung von Echtzeitänderungen des neuronalen Membranpotentials auf der Grundlage der VSD-Fluoreszenz.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Tägliche Vorbereitung der Versuchsapparatur

1. Schalten Sie den Verstärker, den Computer und das Kamerasystem ein, und überprüfen Sie, ob die Software ausgeführt wird.
2. Geben Sie die künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) in ein 50-ml-Röhrchen und blasen Sie sie mit einem Carbogen.
3. Verwenden Sie eine Schlauchpumpe, um den ACSF zirkulieren zu lassen. Stellen Sie die Durchflussrate auf ca. 1 ml/min ein.
Stellen
4. Sie die Höhe der Saugpipette so ein, dass der Flüssigkeitsstand in der Experimentierkammer immer konstant ist.
   Anmerkung: Der Pegel der Lösung ist wichtig, um eine stabile Aufzeichnung zu erhalten, daher sollte die Einstellung mit einem Mikromanipulator erfolgen.
5. Die Erdungselektrode aus gelbem Chip, gefüllt mit 3 M KCl-Agar (2 %), in einen Halter mit einem Ag-AgCl-Draht mit einer kleinen Menge 3 M KCl-Lösung einbauen.
6. Füllen Sie eine kleine Menge ACSF (ca. zwei Drittel des Volumens) mit einer konischen, dünnen, gelben Spitze in die Glaselektrode (1 mm Außendurchmesser, 0,78 mm Innendurchmesser, gezogen mit einem Mikropipettenzieher) und legen Sie sie in den Elektrodenhalter.
7. Befestigen Sie den Halter an der im Manipulator installierten Stange. Bei Verwendung eines Verstärkers ist darauf zu achten, dass der Elektrodenwiderstand ca. 1 MΩ,
   Anmerkung: Die Patch-Elektrode mit langem Schaft und breiter Öffnung (4-8 μm Öffnung) sollte sich gut für Feldaufnahmen und als Stimulationselektrode eignen.

>2. Starten einer Aufnahmesitzung

1. Nehmen Sie mit einer Pinzette ein Scheibenpräparat aus der feuchten Kammer.
2. Legen Sie die Scheibe schnell auf eine Experimentierkammer unter dem Mikroskop (Abbildung 1).
3. Schieben Sie den Rand des Rings fest in den O-Ring aus Silikon. Achten Sie darauf, dass die Membran oder der Boden der Experimentierkammer nicht zerbrechen.
   Anmerkung: Die Richtung der Scheibe sollte in Bezug auf die Richtung der Stimulations- und Aufzeichnungselektroden im Sichtfeld berücksichtigt werden. Die gesunde Scheibe sollte am Membranfilter haften, damit keine anderen Geräte wie Gewichte und Nylonnetze zum Fixieren der Scheiben verwendet werden müssen.
4. Platzieren Sie die Spitze der Stimulationselektrode und die Feldpotential-Aufzeichnungselektrode mit dem Durchlicht auf der Scheibe unter dem Mikroskop.
5. Verwenden Sie das elektrophysiologische Aufzeichnungssystem, um die Reaktion zu überprüfen. Bestätigen Sie die übliche (nicht gefärbte) elektrophysiologische Aufzeichnung mit der angegebenen Konfiguration.
   Anmerkung: Die Aufzeichnungselektrode kann weggelassen werden, ist aber nützlich, um die Physiologie der Scheibe zu überprüfen.
6. Stellen Sie die Intensität des Anregungslichts auf ca. 70-80 % der maximalen Kapazität an der Kamera ein, die 13-15 mW/cm² an der Probe entspricht, wenn bei 10 kHz mit 5x Wasserimmersionsobjektiv und 1x PLAN APO-Tubusobjektiv abgetastet wird. Die Wellenlänge des Anregungslichts beträgt 530 nm, und der Emissionsfilter muss > 590 nm betragen.
   Anmerkung: Verwenden Sie einen Verschluss, um die Menge des Anregungslichts zu minimieren. Kontinuierliche Lichteinwirkung kann die Physiologie der Scheibe verschlechtern. Die mögliche schädliche Wirkung des Lichts hängt von der Intensität und Dauer des Lichts ab. Verwenden Sie elektrophysiologische Aufzeichnungen, um die Wirkung von Licht zu beurteilen. Bei einer Festigkeit von 13-15 mW/cm² sollte eine Beanspruchung von etwa 1 s die Obergrenze der Toleranz sein.
7. Stellen Sie den Fokus mit dem Erfassungssystem mit der Leuchtstoffröhre ein, da der Fokus je nach Wellenlänge unterschiedlich sein kann, und starten Sie die Erfassung.
8. Untersuchen Sie die Daten in einer Bildaufnahmesoftware.
   Anmerkung: Für die detaillierte Analyse haben wir ein Original-Mikroprogrammierungspaket einer numerischen Analysesoftware verwendet.

Ergebnisse

Abbildung 1. Aufzeichnungssystem für optische Signale aus der Schnittvorbereitung. (A) Ein Foto des Mikroskops, mit dem die Schnitte im aktuellen Manuskript abgebildet wurden. Die Optik besteht aus einer Objektivlinse (5x NA0,60), einem Spiegelkasten für dichroitische Filter (580 nm) und einer Projektionslinse (Tubus x1,0). Eine Hochgeschwindigkeitskamera wird über einen C-Mount a...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hochgeschwindigkeits-Bilderfassungssystem	Brainvision Co., Ltd.	MiCAM - Ultima	Bildgebendes System
Hochgeschwindigkeits-Bilderfassungssystem	Brainvision Co., Ltd.	MiCAM 02	Bildgebendes System
Makroscepe für die Weitfeld-Bildgebung	Brainvision Co., Ltd.	THT-Makroskop	Makroskop
Hochleistungs-LED-Beleuchtungssystem mit Fotodiododen-Stabilisierer	Brainvision Co., Ltd.	LEX-2G	LED-Beleuchtung
Software zur Bildaufnahme	Brainvision Co., Ltd.	BV-ana	Software zur Bilderfassung
Multifunktionaler elektrischer Stimulator	Brainvision Co., Ltd.	ESTM-8	Stimulus-Isolator+AD/DA-Wandler
Membranfilter zur Unterstützung der Scheibe	Merk Millipore Ltd., MA, Vereinigte Staaten von Amerika	Omnipore, JHWP01300, 0,45 μm Poren,	Membranfilter/ 0.45 13
Software für numerische Analysen	Wavemetrics Inc., OR, USA	IgorPro	Software analysieren
Stimulations-Isolator	WPI Inc.	Nr. A395	Stimulus-Isolator
AD/DA-Wandler	Instrutech	ITC-18	AD/DA-Wandler
Spannungsempfindlicher Farbstoff Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Katalognummer: D-1199	VSD: Di-4-ANEPPS
Polyethoxyliertes Rizinusöl	Sigma-Aldrich	Cremophor EL C5135	polyethoxyliertes Rizinusöl