Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Tiere
- Verwenden Sie gentechnisch veränderte OR-IRES-tauGFP (OR = Olfaktorischer Rezeptor, IRES = Internal ribosome entry site, tauGFP = tau-green fluorescent protein) Mäuse, die im Jackson Laboratory erhältlich sind. Diese Mäuse wurden im Labor von Dr. Peter Mombaerts entwickelt, um das Axon-Targeting und die Entwicklung des olfaktorischen Systems zu analysieren. Zum Beispiel trägt die MOR23-IRES-tauGFP-Linie mit der Best.-Nr. 006643 den offiziellen Stammnamen B6; 129P2-olfr16tm2Mom/MomJ; ebenso trägt die SR1-IRES-tauGFP-Linie mit der Best.-Nr. 6717 den offiziellen Namen B6; 129P2-olfr124tm1Mama/MamaJ.
- In Bezug auf das Alter der Tiere: Für ein besseres Ergebnis des Protokolls verwenden Sie Tiere im Alter zwischen 2 und 4 Wochen. In dieser Altersgruppe ist die Dissektion einfacher (weichere Knochen, festeres Riechepithel) und die dendritischen Knubbel sind im Vergleich zu älteren Tieren größer.
>2. Herstellung von Elektroden und Lösungen
- Für die stimulierenden Pipetten: Kaufen Sie vorgezogene Stimulationspipetten. Andernfalls bereiten Sie sie manuell vor.
- Biegen Sie mit einer Flamme sechs 1-mm-Glaspipetten in einem Abstand von etwa 1 cm von der Spitze entfernt. Führen Sie diese sechs Pipetten plus einen geraden 7. in 1,5 cm Schrumpfschlauch ein, der durch eine Öse verstärkt ist.
- Durch die Hitze schrumpft der Schlauch, um die Fässer zusammenhalten. Befestigen Sie einen zusätzlichen Schrumpfschlauch am anderen Ende der Zylinder. Ziehen Sie an dieser stimulierenden Pipette mit einem Mehrzylinder-Abzieher.
- Gib etwas weißen Flüssigkleber um die Öse, um die verbogenen Spitzen zu verstärken. Über Nacht trocknen lassen (O/N).
- Bereiten Sie 1 oder 2 l normale extrazelluläre Ringer-Lösung vor (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, Glukose 15; pH 7,6 und 305 mOsm). Bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahren.
- Intrazelluläre Stammlösung (in mM) herstellen: KCl 70, KOH 53, Methansulfonsäure 30, Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) 5, 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) 10, Saccharose 70, pH 7,2 (KOH) und 310 mOsm. Bis zur Verwendung bei 4 °C aufbewahren. Gut für mehrere Wochen.
- Bereiten Sie die intrazelluläre Aufzeichnungslösung mit Nystatin aus dem Stegreif (in letzter Minute) vor dem Experiment vor.
- 3 mg Nystatin wiegen, 50 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) zugeben; 20 Sekunden Vortexen, dann 2-3 Minuten beschallen, bis es vollständig verdünnt ist.
- 20 μl DMSO-Nystatin-Lösung in 5 ml intrazelluläre Stammlösung geben. 20 Sek. Vortexen, dann 3 Min. beschallen. Halten Sie diese Lösung bei 4 °C und schützen Sie sie vor direktem Licht, Nystatin ist lichtempfindlich. Diese Lösung kann einige Stunden lang verwendet werden. Jeden Tag ersetzen.
- Sobald das olfaktorische Epithelpräparat unter dem Mikroskop ist, nehmen Sie etwas von dieser Lösung in einer 1-ml-Spritze mit einer flammenverlängerten gelben Spitze, um die Elektroden zu füllen; vor direktem Licht schützen. Sobald die Nystatinlösung Raumtemperatur (RT) erreicht hat, ist sie nicht stabil; Ersetzen Sie die Lösung stündlich in der 1 ml Spritze oder bewahren Sie sie in Eis auf.
- Ziehen Sie die Aufzeichnungselektroden mit einem Abzieher, um einen langen Hals und eine kleine Spitze (~2 μm) mit einem Widerstand von 15-20 MΩ mit der internen Nystatinlösung zu erhalten.
- Odorierlösung in 0,5 m Höhe in DMSO unter dem Abzug herstellen, aliquotieren und bis zur Verwendung bei -20 °C aufbewahren. Verdünnen Sie das Odormittel in der Ringer-Lösung bis zur gewünschten Konzentration. Füllen Sie die stimulierende Pipette.
>3. Zubereitung des Riechepithels
Hinweis: OR-IRES-tauGFP-Mäuse exprimieren das tauGFP unter der Kontrolle des OR-Promotors. Bei diesen Mäusen sind alle Neuronen, die das OR von Interesse exprimieren, mit GFP markiert. Dieses Protokoll ist für ORs geeignet, die in allen Zonen exprimiert werden. Dissektionen und Aufzeichnungen sind jedoch bei OPs, die in der dorsalen Zone exprimiert werden, einfacher.
- Betäuben Sie das Tier durch Injektion einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (150 mg/kg bzw. 10 mg/kg Körpergewicht). Die Enthauptung kann bei jungen Mäusen mit einer scharfen Schere oder bei älteren Mäusen mit einer ordnungsgemäß gepflegten Nagetierguillotine durchgeführt werden.
- Führen Sie mit einer Ringpräparierschere einen medialen Längsschnitt durch die Rückenhaut durch. Entferne die Haut, indem du sie auseinanderziehst. Schneide mit der Schere die Unterkiefer am Kiefergelenk ab. Entfernen Sie die oberen Frontzähne durch einen koronalen Schnitt parallel zu den Zähnen.
- Machen Sie einen koronalen Schnitt des Kopfes hinter den Augen und behalten Sie nur den vorderen Teil des Kopfes. Tauchen Sie es in eine eiskalte Ringer-Lösung für das Sezieren unter dem Zielfernrohr.
- Präparieren Sie unter dem Zielfernrohr: Machen Sie auf der Bauchseite einen Längsschnitt entlang des Oberkiefers/der Zähne. Schneiden Sie die dorsalen Knochen in Längsrichtung entlang der dorsolateralen Seite der Nasenhöhle. Entfernen Sie die meisten Knochen und Gaumen; Übertragen Sie das Septum und das daran befestigte Epithel in oxygeniertem Ringer bei RT.
- Für die abschließende Dissektion: Unmittelbar vor Beginn der Aufnahmesession das Epithel mit einer Pinzette von der darunterliegenden Nasenscheidewand abziehen. Lösen Sie das Epithel mit einer Pinzette und mit zwei 4-5 mm Scherenschnitten (verwenden Sie eine Mikro-Vannas-Schere) am vorderen Teil des Septums, wo die Adhäsion stärker ist.
- Entferne vorsichtig das vomeronasale Organ, indem du es entlang seiner dorsalen Verbindung zum Septumepithel herausschneidest. Übertragen Sie das Epithel mit der Schleimschicht nach oben in eine Aufzeichnungskammer. Halten Sie es flach in der Kammer mit einer Harfe.
- Installieren Sie die Kammer unter einem aufrechten Mikroskop, das mit einer Fluoreszenzoptik und einer empfindlichen Kamera ausgestattet ist. Visualisieren Sie die Vorbereitung auf dem Computerbildschirm bei hoher Vergrößerung durch ein 40-faches Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0,8) und eine zusätzliche 2- oder 4-fache Vergrößerung, die durch eine Lupe erreicht wird. Kontinuierlich mit sauerstoffhaltigem Ringer bei RT (1-2 ml/min) perfundieren.
>4. Aufnahme-Sitzung
- Suche nach fluoreszierenden Zellen: Anregung der Präparation bei 480 nm für EGFP, die Licht im Bereich von 530-550 nm emittiert; Targeting eines dendritischen Knubbels, der in der Fluoreszenz und im Hellfeld zuverlässig sichtbar ist.
- Füllen Sie die Elektrode mit intrazellulärer Lösung mit Nystatin; entfernen Sie Blasen, indem Sie vorsichtig auf die Elektrode klopfen.
- Elektrode auf Elektrodenhalter einführen, Überdruck in die Pipette ausüben; Der Widerstand sollte 15-20 MΩ betragen.
- Bringen Sie die Elektrode in die Nähe der Zelle. Sobald der Widerstand ~40 MΩ erreicht, lassen Sie den Überdruck ab und üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um eine Gigadichtung zu erreichen.
- Sobald die Versiegelung erreicht ist, stellen Sie das Membranpotential auf etwa -75 mV ein.
- Sobald die Zelle geöffnet ist, fahren Sie mit Stimulationsprotokollen und pharmakologischen Behandlungen fort. Um die Reaktion auf eine Stimulation mit einem einzelnen Geruchsstoff zu messen, zeichnen Sie 200-500 ms spontane Aktivität auf, stimulieren Sie 500 ms lang und messen Sie die Reaktion der Zelle bis zu 10 Sekunden lang. Für pharmakologische Behandlungen perfundieren Sie die pharmakologischen Wirkstoffe in der gewünschten Konzentration.
