Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Ausrichtung des Strahlengangs zwischen der CMOS-Kamera (komplementärer Metalloxid-Halbleiter) und dem einzelnen oder verzweigten Patchkabel
- Lösen Sie alle Schrauben am 5-Achsen-Translator (Abbildung 1B).
- Schrauben Sie das Patchkabel (Abbildung 1B) an den Adapter [SMA (Subminiatur A) oder FC (LWL-Stecker)], der am 5-Achsen-Konverter befestigt ist.
- Schalten Sie das 470-nm-Anregungslicht (Abbildung 1B) bei geringer Leistung (100 μW) ein und platzieren Sie die Spitze des Patchkabels auf einem autofluoreszierenden Kunststoffschieber. Dies hat keinen Einfluss auf zukünftige Aufnahmen, sondern dient lediglich der Visualisierung des Ausrichtungsprozesses.
- Nehmen Sie von der CMOS-Kamera (Abbildung 1B) im Live-Modus auf. Erhöhen Sie die Verstärkung oder passen Sie die Nachschlagetabelle (LUT) an, bis das Bild nicht mehr vollständig schwarz ist. Es geht darum, ein Bild im Brennpunkt des Objektivs sehen zu können (Abbildung 1B).
- Schieben Sie den 5-Achsen-Konverter in Richtung des Objektivs und stellen Sie sicher, dass das 470-nm-Licht auf der Faser am SMA- oder FC-Ende des Patchkabels zentriert ist, bis ein Bild auf der Kamera aufgelöst werden kann.
- Passen Sie die X- und Y-Achsen an, bis das Bild zentriert und gut aufgelöst ist.
- Visualisieren Sie das Licht, das von der Aderendhülse des Patchkabels ausgestrahlt wird. Er sollte als isotroper Kreis erscheinen. Wenn ein verzweigtes Patchkabel verwendet wird, sollte die Lichtmenge, die an den Aderendhülsen jedes Patchkabels abgestrahlt wird, ähnlich sein. Wenn der Kreis nicht isotrop ist oder das emittierte Licht ungleich ist, passen Sie den 5-Achsen-Translator in der X-Y-Achse an.
2. Aufbau von ROIs um Fasern zur Messung der mittleren Fluoreszenzintensität
- Schalten Sie alle Anregungslichter ein, um die Fasern besser zu visualisieren. Passen Sie die Kameraverstärkung so an, dass keine Pixel gesättigt sind und ein klares Bild der Fasern vorhanden ist.
- Live-Aufnahme oder Aufnahme eines vorläufigen Bildes.
- Zeichnen Sie ROIs um die Fasern herum und bewahren Sie sie für die Messung der mittleren Intensitätswerte während der Aufzeichnung auf (Abbildung 1A).
- Bei Aufzeichnungen mit mehreren Fasern ist die Unabhängigkeit der Signale zu testen.
- Live-Aufnahme von allen Fasern.
- Richten Sie eine Faser auf eine Lichtquelle und klopfen Sie mit einem Finger. Große Schwankungen sollten nur in diesem Kanal auftreten (akzeptable Leckage 1:1000).
- Wenn die Signale nicht unabhängig sind, zeichnen Sie konservativere ROIs neu und wiederholen Sie den Unabhängigkeitstest.
- Um zu beschriften und zu verfolgen, welcher ROI welcher Faser entspricht, kann farbiges Klebeband oder Nagellack auf das Ende der Fasern aufgetragen werden. Machen Sie vor Beginn eines Experiments ein Foto als sekundäre Erinnerung.
>3. Aufbau der Aufnahmearena
- Hängen Sie das Patchkabel mit Ständern, Klemmen oder Halterungen über die Arena.
- Achten Sie darauf, dass sich das Tier frei in der gesamten Arena bewegen kann, ohne durch die Länge der Faser behindert
zu werden.
- Wenn eine operante Box oder ein offenes Feld verwendet wird, stellen Sie sicher, dass das Patchkabel das Tier mit minimaler Biegung erreichen kann. Wenn dies einen Nasenstich erfordert, stellen Sie sicher, dass über Kopf genügend Platz ist, um ein Verbiegen der Faser zu verhindern. Vermeiden Sie übermäßiges Biegen oder Verdrehen des Patchkabels.
>4. In-vivo-Aufnahmen
- Untersuchen Sie das distale Ende der Fasern des Patchkabels visuell mit dem Auge und mit einem Minifasermikroskop. Wenn die Oberfläche der Fasern zerkratzt ist, polieren Sie die Fasern mit einer Faserpolier-/Läppfolie mit feiner Körnung (1 μm und 0,3 μm) nach.
- Reinigen Sie die distalen Enden des Patchkabels mit 70 % Ethanol und einem Wattestäbchenapplikator.
- Reinigen Sie die faseroptischen Kanülen mit 70 % Ethanol und einem Wattestäbchenapplikator.
- Verbinden Sie das Aderendhülsenende des Patchkabels mit einer Keramik-Spalthülse, die mit einem schwarzen Schrumpfschlauch bedeckt ist, mit der implantierten Faser. Stellen Sie sicher, dass die Hülse während der Verbindung fest sitzt. Andernfalls verwenden Sie eine neue Hülle.
Anmerkung: Wenn zwischen der Ferrule des Patchkabels und dem Implantat Platz ist, kommt es zu einem großen Signalverlust, und die Aufnahmen funktionieren nicht.
- Lassen Sie das Tier einige Minuten lang genesen, bevor es mit dem Verhaltenstest beginnt.
- Starten Sie die Aufzeichnung des optischen Signals und führen Sie das Experiment durch.
- Behalten Sie während der Aufnahme die Live-Spur genau im Auge, um eine hohe Qualität der Aufnahmen zu gewährleisten. Es wird erwartet, dass das Signal in den ersten 2 Minuten der Aufnahme in Abhängigkeit von der Zeit schnell abnimmt. Dieser Effekt wird durch den wärmevermittelten LED-Zerfall verursacht, wobei die Zunahme der Wärme den Widerstand des optischen Elements erhöht.
- Kommt es zu einem Sprung im Signal, der die Ein-/Aus-Kinetik von GCaMP überschreitet, deutet dies oft darauf hin, dass die Hülse nicht dicht genug ist und sich der Abstand zwischen dem Patchkabel und dem Implantat verändert. Brechen Sie in diesem Fall den Versuch ab und verbinden Sie das Tier mit einer neuen Hülle wieder.
