Eine elektrophysiologische Studie von Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Synapsen in Hirnschnitten von Mäusen

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Lösungen

1. Lösung zum Sezieren
   1. Um die Exzitotoxizität zu reduzieren, bereiten Sie eine Lösung auf Cholinbasis her, die während der Dissektion verwendet wird, wie hier (in mM) dargestellt: 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 Cholinchlorid, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl₂ und 25 Glukose. Bereiten Sie die Präparierlösung weniger als 1 Woche vor dem Experiment vor.
2. Lösung für die Aufzeichnung
   1. Bereiten Sie eine künstliche Lösung für die zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (ACSF) vor, die (in mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 2,5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ und 25 Glukose enthält. Fügen Sie 50 μM D-2-Amino-5-phosphonovaleriansäure (D-APV) und 10 μM SR 95531 Hydrobromid (Gabazin) hinzu, um die N-Methyl-D-aspartat (NMDA) bzw. GABAA-Rezeptoren zu blockieren.
3. Intrazelluläre Lösung
   1. Bereiten Sie eine intrazelluläre Lösung vor, die (in mM): 35 Cs-Gluconat, 100 CsCl, 10 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethahansulfonsäure (HEPES), 10 Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 0,1 D-600 (Methoxyverapamilhydrochlorid) enthält. Stellen Sie den pH-Wert mit CsOH auf 7,3 ein. Die Stammlösung filtrieren, aliquotieren und bis zur Verwendung bei -20 °C lagern.

>2. Sezieren

1. Bereiten Sie zwei Schnittkammern vor, von denen eine mit 100 mL der Dissektionslösung und die andere mit 100 mL Aufnahmelösung gefüllt ist. Die beiden Becher in ein Wasserbad (37 °C) stellen und die Lösungen vor der Dissektion mindestens 15 min mit Carbogen sprudeln.
2. Füllen Sie ein Plastikbecherglas mit 250 ml nahezu eiskalter (aber nicht gefrorener) Sezierlösung. Blase mit Carbogen mindestens 15 min vor Gebrauch.
3. Füllen Sie eine Petrischale aus Kunststoff (100 mm x 20 mm), in der die Hirndissektion durchgeführt wird, mit der Kaltdissektionslösung. Legen Sie ein Stück Filterpapier in den Deckel der Petrischale.
4. Kühlen Sie die Präparierkammer des Vibratoms ab.
5. Betäuben Sie eine Maus mit 2,5% Isofluran, z.B. im Mauskäfig. Sobald die Maus nicht auf ein Schwanzkneifen reagiert, enthaupten Sie die Maus in der Nähe des Gebärmutterhalsmarks und tauchen Sie den Kopf in die eiskalte Dissektionslösung im Boden der Petrischale.
6. Schneiden Sie die Haut des Kopfes von kaudal bis nasal ab und halten Sie sie seitlich mit den Fingern, um den Schädel freizulegen. Um das Vorderhirn herauszunehmen, schneiden Sie zuerst den Schädel zusammen mit der hinteren-vorderen Mittellinie und dann zwei weitere Male durch die koronale Naht und die lambdoide Naht (Abbildung 1A).
7. Entfernen Sie den Schädel zwischen der Kronennaht und der Lambdoidnaht, so dass das Großhirn freiliegt. Schneiden Sie den Riechkolben ab und trennen Sie mit einer feinen Klinge das Vorderhirn vom Mittelhirn (Abbildung 1B). Entfernen Sie das Gehirn mit einem dünnen Spatel aus dem Schädel und legen Sie es auf das Filterpapier im Deckel der Petrischale.
   Anmerkung: Die Schritte 2.6 und 2.7 sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Zelltod zu reduzieren.
8. Um die Integrität der sensorischen und kortikalen Inputs für das dLGN im Hirnschnitt zu erhalten, trennen Sie die beiden Hemisphären mit einem parasagittalen Schnitt mit einem Winkel von 3-5° (Abbildung 1C, D). Trocknen Sie die mediolateralen Ebenen der beiden Halbkugeln, indem Sie sie auf das Filterpapier legen und dann mit einem Winkel von 10−25° zur horizontalen Ebene auf den Schneidetisch kleben (Abbildung 1E).
9. Platzieren Sie den Tisch in der Mitte der Metallpufferschale und gießen Sie den Rest der eiskalten Dissektionslösung vorsichtig in die Pufferschale. Führen Sie diesen Schritt vorsichtig aus, da ein starker Guss das eingekleistete Gehirn entfernen kann (Abbildung 1F).
10. Setzen Sie die Pufferschale in die mit Eis gefüllte Schale ein, um die niedrige Temperatur während der Dissektion aufrechtzuerhalten. Schneiden Sie 250 μm Scheiben mit einer Rasierklinge bei einer Geschwindigkeit von 0,1 mm/s und einer Amplitude von 1 mm.
11. Bewahren Sie die Scheiben etwa 30 Minuten lang in der mit sauerstoffhaltiger Dissektionslösung bei 34 °C gefüllten Haltekammer auf und lassen Sie die Scheiben dann weitere 30 Minuten in der Aufnahmelösung bei 34 °C ziehen.
12. Nach der Gewinnung die Scheibenhaltekammer aus dem Wasserbad nehmen und die Scheiben bis zur Verwendung in Versuchen bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren.

>3. Elektrophysiologie

1. Ziehen Sie Pipetten mit Borosilikatglaskapillaren und einem Filamentabzieher. Halten Sie den Widerstand von Aufnahmepipetten bei 3-4 MΩ. Ziehen Sie stimulierende Pipetten nach dem gleichen Protokoll, aber brechen Sie die Spitze nach dem Ziehen leicht, um den Durchmesser zu vergrößern. Füllen Sie die Aufzeichnungspipetten mit der intrazellulären Lösung und Biocytin, während Sie die Stimulationspipetten mit der Aufzeichnungslösung füllen.
2. Legen Sie die Schichten in die Aufnahmekammer und perfundieren Sie die Schichten kontinuierlich mit sauerstoffhaltiger Aufnahmelösung bei RT. Überprüfen Sie alle Schichten und wählen Sie diejenigen aus, die einen intakten optischen Trakt aufweisen.
3. Visualisieren Sie die Scheibe und die Zellen mit einem aufrechten Mikroskop, das mit einer Infrarot-Differenzinterferenzkontrast-Videomikroskopie (IR-DIC) ausgestattet ist.
   Anmerkung: Relaisneuronen unterscheiden sich von Interneuronen durch ihre größere Somagröße und mehr primäre Dendriten (Äste, die aus dem Soma hervorgehen). Interneurone weisen eine bipolare Morphologie mit einem kleineren Soma auf.
4. Setzen Sie die Stimulationspipette auf die Schnittscheibe, bevor Sie die Zelle mit der Aufnahmepipette flicken. Um retinogenikulate Synapsen zu untersuchen, platzieren Sie die stimulierende Pipette direkt auf den Sehtrakt, wo die Axonfasern von retinalen Ganglienzellen gebündelt sind (Abbildung 2A). Um kortikogenikulate Synapsen zu analysieren, platzieren Sie die Stimulationselektrode auf dem Nucleus reticularis thalami, der rostroventral neben dem dLGN liegt (Abbildung 2B).
5. Sobald die Aufzeichnungspipette in die Aufzeichnungslösung eingetaucht ist, legen Sie einen Spannungsschritt von 5 mV an, um den Pipettenwiderstand zu überwachen. Stellen Sie das Haltepotenzial auf 0 mV ein und heben Sie das Offset-Potential auf, so dass der Haltestrom 0 pA beträgt.
6. Nähern Sie sich der Zelle mit der Aufzeichnungspipette, während Sie Überdruck ausüben. Wenn die Pipette in direktem Kontakt mit der Zellmembran steht, lassen Sie den Überdruck ab und stellen Sie das Haltepotenzial auf -70 mV ein. Üben Sie einen leichten Unterdruck aus, damit sich die Zellmembran so an der Glaspipette festsetzen kann, dass sich eine Gigaohm-Dichtung bildet (Widerstand >1 GΩ). Kompensieren Sie die Pipettenkapazität und öffnen Sie die Zelle durch Anlegen von Unterdruckimpulsen.
7. Um die synaptische Funktion zu untersuchen, legen Sie 0,1 ms Stromimpulse (ca. 30 μA) über die Stimulationspipette an. Wenn keine synaptischen Reaktionen beobachtet werden, müssen die stimulierenden Pipetten möglicherweise ausgetauscht werden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Stimulationspipetten in eine andere Position bringen, damit die aufgezeichnete Zelle nicht verloren geht.
   Anmerkung: In den in Abbildung 2 gezeigten Beispielaufnahmen wurde die synaptische Kurzzeitplastizität untersucht, indem der Sehtrakt oder die kortikogenikulären Fasern zweimal mit 30 ms Inter-Stimulus-Intervallen stimuliert wurden. Das Paired-Puls-Ratio (PPR) wurde berechnet, indem die Amplitude des zweiten exzitatorischen postsynaptischen Stroms (EPSC) durch die des ersten EPSC (EPSC2/EPSC1) dividiert wurde. Jedes Stimulationsprotokoll wurde 20 Mal wiederholt. Die EPSC-Amplitude wurde aus den durchschnittlichen Strömen der 20 Sweeps gemessen. Das Zeitintervall zwischen den einzelnen Wiederholungen betrug mindestens 5 s, um eine durch die Wiederholungen induzierte kurzfristige Plastizität zu vermeiden.
8. Überwachen Sie den Serienwiderstand kontinuierlich durch Anlegen eines 5-mV-Spannungsschritts. Verwenden Sie für die Analyse nur Zellen mit einem Serienwiderstand kleiner als 20 MΩ
.

Abbildung 1: Schemata, die das Dissektionsprotokoll darstellen. (A) Horizontale Ansicht des Mäuseschädels, die die Position der ersten Schnitte zeigt. Der erste Schnitt wurde zusammen mit der sagittalen Naht durchgeführt, gefolgt von zwei weiteren Schnitten zusammen mit der koronalen Naht bzw. der lambdoiden Naht. Gestrichelte Linien stellen die Einschnitte dar. (B) Sagittale Ansicht des gesamten Gehirns. Gestrichelte Linien zeigen an, dass das Großhirn vom Riechkolben und dem Mittelhirn isoliert ist. (C-D) Diese Felder zeigen den ersten Schnittwinkel, um die beiden Hemisphären von der horizontalen (C) bzw. koronalen (D) Ansicht zu trennen. (E) Koronale Ansicht einer Hemisphäre im Schnittstadium. Gestrichelte Linien zeigen die Schnittrichtung an. L, M, D und V stellen die lateralen, medialen, dorsalen und ventralen Aspekte der Hemisphäre in den Panels D und E dar. (F) Diagramm der Präparierkammer mit zwei Hemisphären auf dem Schnitttisch. Der gestrichelte Pfeil zeigt die Bewegungsrichtung des Schneidmessers an. A, P und D repräsentieren die vorderen, hinteren und dorsalen Aspekte der linken Hemisphäre.

Abbildung 2: Schichtvorbereitung von dLGN, das die Retinogenikulat- und Kortikogenikulatwege enthält, und Beispielaufnahmen. (A-B) Diese Panels zeigen eine dLGN-Schicht unter Beibehaltung der Retinogenikulat- und Kortikogenikulat-Inputs. Die Stimulationselektrode wurde auf dem Tractus opticus platziert, um die retinogenikulären Synapsen zu aktivieren (A), und auf dem Nucleus reticularis thalami, um die kortikogenikulären Synapsen zu aktivieren (B).