Implantation eines drahtlosen bidirektionalen Mikroelektrodensystems in ein Rattengehirn

Abstract

Quelle: Melo-Thomas, L., et al., Eine drahtlose, bidirektionale Schnittstelle für die In-vivo-Aufzeichnung und Stimulation der neuronalen Aktivität bei frei verhaltenden Ratten. J. Vis. Exp. (2017)

Das Video zeigt ein Verfahren zur Implantation einer drahtlosen bidirektionalen Mehrkanal-Elektrodeneinheit in ein Rattengehirn, um mehrkanalige neuronale Netze aufzuzeichnen und zu stimulieren.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Tiere

1. Männliche erwachsene Wistar-Ratten (200-250 g) in Gruppen von 3-4 unter Standardlaborbedingungen mindestens eine Woche vor der Operation unterbringen, um eine Akklimatisation zu ermöglichen.
2. Zwei Tage nach der Operation Hausratten paarweise. Decken Sie einzelne Käfige mit hohen Acryldeckeln ab. Vermeiden Sie herkömmliche Deckel aus Metallgitter, da Implantate stecken bleiben können, was das Risiko erhöht, dass sie mit der Zeit beschädigt und/oder instabil werden.

>2. Stereotaktische Chirurgie

1. Organisieren und bereiten Sie vor Beginn der Operation die folgenden Geräte und Materialien vor:
   1. Besorgen Sie sich sterile chirurgische Geräte, die aus einer sterilen Schere, einer stumpfen Pinzette, einem Spatel, einer chirurgischen Haarschneidemaschine, einem Zahnbohrer und Wattestäbchen bestehen.
   2. Besorgen Sie sich Medikamente und Chemikalien wie Isofluran, Xylocain, Tramadolhydrochlorid, Dexpantenol-Augensalbe, 3 % Wasserstoffperoxid, Povidon-Jod und 70 % Ethanol.
   3. Besorgen Sie sich Befestigungsmaterial wie Edelstahlschrauben, Acrylharz, UV-Kleber und Kappenschutz.
   4. Erhalten Sie eine Mikroelektrodeneinheit, bestehend aus (i) einer Aufzeichnungs-Einzelelektrode (Quarzglas-isolierte Platin-Wolfram-Mikroelektrode, mit konischer Spitzenform, Außendurchmesser: 80 μm, konische Spitze, Impedanz bei 1 kHz: 500 kOhm) oder einer Tetrode (quarzglasisolierte Platin/Wolfram-Mikroelektrode mit 4 Adern, Außendurchmesser: 100 μm, konische Spitze, Impedanz bei 1 kHz: 500-800 kOhm); (ii) eine Stimulationselektrode (Platin/Iridiumdraht (90 % Platin, 10 % Iridium), Kerndurchmesser 125 μm, Außendurchmesser 150 μm, Impedanz <10 kOhm), die mit einer Kontaktplatte verbunden ist, und (iii) eine Referenzelektrode aus Platindraht (Wellendurchmesser, 100 μm; Abbildung 1A).
   5. Besorgen Sie sich einen Elektrodenhalter, der mit wasserlöslichem Kleber auf die Mikroelektrodeneinheit geklebt ist, und testen Sie die Funktionsfähigkeit mindestens 2 h vorher (Abbildung 1B).
   6. Erhalten Sie ein konventionelles angebundenes System, bestehend aus einem differentiellen Vorverstärker, einem Hauptverstärker und einem Bandpassfilterverstärker für Aufnahmen.
   7. Besorgen Sie sich zusätzliches Material wie Handschuhe, Heizkissen, Spritzen und physiologische Kochsalzlösung.
   8. Besorgen Sie sich Käfige für zu Hause (L x B x H: 42 cm x 26 cm x 38 cm).
2. Vorgehensweise
   HINWEIS: Die Elektrodenimplantation wird während einer konventionellen stereotaktischen Operation unter Isofluran-Anästhesie durchgeführt.
   1. Stellen Sie sicher, dass der Experimentator Handschuhe, eine chirurgische Maske und einen Laborkittel trägt.
   2. Beginnen Sie die Anästhesie, indem Sie das Tier in eine Induktionskammer legen (Isofluran 4-5%, Sauerstofffluss 1 L/min, Dauer ~5 min).
   3. Test auf Verlust der Reflexe (Schwanz- und Zehenreflexe) mit einer Pinzette, um die Tiefenanästhesie zu bestätigen.
   4. Legen Sie den Kopf des Tieres in eine Anästhesiemaske, die um den oberen Schneidezahn des stereotaktischen Rahmens befestigt ist, und stellen Sie die Anästhesie ein (Isofluran 2-3%, Sauerstofffluss 0,7-0,8 l/min).
   5. Fixieren Sie den Kopf des Tieres und richten Sie ihn mit Hilfe von Ohrstangen und oberem Schneidezahn horizontal im stereotaktischen Apparat aus.
   6. Rasieren Sie das Operationsfeld mit einer chirurgischen Haarschneidemaschine oder einer Schere und sterilisieren Sie es mit Povidon-Jod.
   7. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, um Unterkühlung zu verhindern, und behandeln Sie die Augen mit Dexpanthenol-Augensalbe, um ein Austrocknen zu verhindern.
   8. Injizieren Sie Xylocain (0,3-0,4 ml, subkutan, s.c.) in die Mitte des Operationsfeldes.
   9. Testen Sie erneut auf Reflexverlust.
   10. Machen Sie einen kleinen Schnitt (1,5 cm) mit einem Skalpell in der Mitte des Operationsfeldes, um den Schädel freizulegen. Trennen Sie die Haut sanft und entfernen Sie Restgewebe mit einer Pinzette, einer Schere und einem Spatel.
   11. Reinige den Schädel vorsichtig mit Wasserstoffperoxid-beschichteten Wattestäbchen.
   12. Bohren Sie 4-5 kleine Löcher (4,7 mm) in den Schädel zur Befestigung von Edelstahlschrauben.
   13. Verbinden Sie die Mikroelektrodeneinheit/den Elektrodenhalter mit dem Vorverstärker und befestigen Sie sie an dem stereotaktischen Mikromanipulator (Abbildung 1B und 1C).
   14. Bohren Sie ein Loch (ca. 7 mm) in den Schädel über dem Zielbereich unter Verwendung von Koordinaten aus einem Gehirnatlas entsprechend dem verwendeten Tier. Positionieren Sie in der vorliegenden Studie die Elektrodenspitzen, die auf den Colliculus inferior gerichtet sind, anhand der folgenden Koordinaten, wobei das Bregma als Referenz dient: anterior/posterior, -8,8 mm; medial/lateral, 1,5 mm; und dorsal/ventral, 3,5 mm.
   15. Absorbieren Sie jegliches Blut mit Wattestäbchen.
   16. Führen Sie die Mikroelektrodeneinheit vertikal ein, bis die Elektrodenspitzen den Zielbereich erreichen.
   17. Positionieren Sie das Massekabel entlang der Edelstahlschrauben und unter der Haut.
   18. Überwachen Sie die Spike-Aktivität und passen Sie die Elektrodenposition mit dem Mikromanipulator sorgfältig an, bis Sie eine Zone aktiver Neuronen in der Zielstruktur erreichen, und erkennen Sie neuronale Aktivität mit einem Signal-Rausch-Verhältnis, das für die Spike-Sortierung geeignet ist.
   19. Befestigen Sie die Mikroelektrodeneinheit mit ultraviolettem Kleber am Schädel und bedecken Sie die Kontaktscheibe und die Schrauben mit Acrylharz.
   20. Injizieren Sie physiologische Kochsalzlösung (1 ml i.p.) und Tramadol (25 mg/kg, s.c.), um Dehydration zu verhindern bzw. eine postoperative Analgesie zu gewährleisten.
   21. Trennen Sie die Mikroelektrodeneinheit mit einer in Wasser getränkten Bürste vom Elektrodenhalter.
   22. Stoppen Sie die Anästhesie und entfernen Sie die Ratte vorsichtig aus dem stereotaktischen Rahmen. Trennen Sie den Vorverstärker von der Mikroelektrodeneinheit.
   23. Schließen Sie den Kappenschutz an der implantierten Mikroelektrodeneinheit an und trennen Sie ihn nur während der experimentellen Verfahren.

Results

Abbildung 1: TWS-Mikroelektrodeneinheit. (1) Aufnahme einer Einzelelektrode/Tetrode, (2) Stimulationselektrode, (3) Elektrodenfaser-Verbindungsplatine, (4) flexible Verbindungskabel, (5) Erdungskabel, (6) Anschlussplatine, (7) Stecker oder Buchse für TWS-System (A); TWS-Mikroelektrodeneinheit, die mit dem Vorverstärker (8) und dem Halter (9) verbunden ist; (B) ber...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thomas Funksystem (TWS) Version 2.0	Thomas RECORDING GmbH	AN001165	Das Thomas Wireless System (TWS) Version 2.0 ist ein tragbares Mehrkanal-Telemetriesystem mit Laptop, einem vorinstallierten Microsoft Windows-Betriebssystem und TWS-Steuerungssoftware. Der TWS umfasst: einen rauscharmen 4-Kanal-Vorverstärker und einen programmierbaren Hauptverstärker mit fester Bandbreite, einen einkanaligen Konstantstromstimulator zum Anlegen von biphasischen Stromimpulsen, einen softwareprogrammierbaren Mikrostimulator, ein implantierbares Stecksystem und eine grundlegende Kopftischeinheit für die Montage an einem Tier. Das System wird mit einem Transceiver mit USB-Anschluss für Laptops oder Desktop-PCs ausgeliefert, die Steuerungssoftware läuft unter dem Microsoft-Betriebssystem Windows. Das TWS-System kann zur extrazellulären neuronalen Stimulation und Aufzeichnung bei sich frei verhaltenden Kleintieren (z.B. Ratten, Meerschweinchen) eingesetzt werden. Dieses System kann auch für den Einsatz bei größeren Tieren (z.B. Primaten) angepasst werden.
Software für Thomas Wireless System (TWS)	Thomas RECORDING GmbH	Enthalten in AN001165	Die Software für das Thomas Wireless System läuft unter dem Betriebssystem Microsoft Windows und stellt die grafische Benutzeroberfläche (GUI) für das Thomas Wireless System (TWS) zur Verfügung. Die TWS-GUI bietet die vollständige Kontrolle über die TWS-Funktionen: 4-Kanal-Aufnahme und 1-Kanal-Stimulation.
Implantierbare Tetrode für Aufnahme (4 Kanäle) und Stimulation (Einkanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001132	Implantierbare Tetrode für Aufnahme (4 Kanäle) und Stimulation (Einkanal) zur Verwendung mit Thomas Wireless Systems (TWS). Tetrodenspezifikationen für die Aufnahme: Tetrodenfasermaterial: Quarzglasisolierte Platin-Wolframfaser, Außendurchmesser der Tetrodenfaser: 100 μm, Spitzenform D, Impedanz 0,5-0,8 MOHm; Referenzelektrode: Spitzenform: D; Impedanz: 300-500kOhm; Material: Quarzglas-isoliertes Platin/Wolfram; Spezifikation der Stimulationselektrode: Fasermaterial: Platin/Iridium, Durchmesser: 125μm, lackisoliert, Spitzenform: D, Impedanz: < 10kOhm, Abmessungen der Elektrode können vom Endbenutzer angegeben werden
Implantierbare Mikroelektrode zur Aufzeichnung (Einkanal) und Stimulation (Einkanal)	Thomas RECORDING GmbH	AN001118	Implantierbare Mikroelektrode zur Aufzeichnung (einkanalig) und Stimulation (einkanalig) zur Verwendung mit Thomas Wireless Systems (TWS). Spezifikationen der Aufnahmeelektrode: Elektrodenfasermaterial: Quarzglasisolierte Platin-Wolframfaser, Außendurchmesser der Elektrodenfaser: 80 μm / 250 μm (bitte angeben), Spitzenform D, Impedanz 0,5-0,8 MOHm; Referenzelektrode: Spitzenform: D; Impedanz. 300-500kOhm; Material: Quarzglas-isoliertes Platin/Wolfram; Spezifikation der Stimulationselektrode: Fasermaterial: Platin/Iridium, Durchmesser: 125μm, lackisoliert, Spitzenform: D, Impedanz: < 10kOhm
Halterung für Elektrodenimplantation	Thomas RECORDING GmbH	AN000838	Speziell gebogener Metallstab für die Mikroelektrodenimplantation für Standard-Elektrodenhalter. Der Stab wird verwendet, um eine implantierbare Elektrode zu halten. Die implantierbare Elektrode wird mit dem speziellen wasserlöslichen Kleber Thomas RECORDING (AN001080) am Stab befestigt. (Elektrodenhalter ist nicht im Lieferumfang enthalten)
Ersatz-Akku-Netzteil für das Thomas Wireless System (3,7V/230mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001208	Ersatzakku (Akku) für Thomas Wireless System mit einer Kapazität von 230mA für ca. 1h Betriebszeit. (Größe: 27mm x 20mm x 6mm, Gewicht ca. 6g)
Ersatz-Akku-Netzteil für das Thomas Wireless System (3,7V/450mAh)	Thomas RECORDING GmbH	AN001209	Ersatzakku (Akku) für Thomas Wireless System mit einer Kapazität von 450mA für mehr als 1h Betriebszeit. (Größe: 48mm x 30mm x 4mm, Gewicht ca. 11g)
Akkuladegerät für Thomas Wireless System (TWS) Akkus	Thomas RECORDING GmbH	AN001207	Netzladegerät für die Thomas Wirless System (TWS) Akkus (AN001209 und AN001209)
Wasserlöslicher Kleber	Thomas RECORDING GmbH	AN001080	Thomas RECORDING wasserlöslicher Elektrodenkleber ist ein speziell ausgewähltes Produkt für den Einsatz mit implantierbaren Mikroelektroden in der neurowissenschaftlichen Forschung. Seine einzigartigen Eigenschaften sorgen für eine starre Verbindung zwischen Elektrode und Befestigungsvorrichtung, obwohl es leicht mit warmem Wasser entfernt werden kann. Der wasserlösliche Elektrodenkleber Thomas RECORDING kann out-of-the-box, ohne zeitaufwändige Vorbereitung, verwendet werden. Thomas RECORDING wasserlöslicher Elektrodenkleber ist nicht schädlich für Mensch, Tier und Umwelt. Menge: 1 Schachtel à 10 Gramm
Miniatur-Differenzvorverstärker	Thomas RECORDING GmbH	AN000329	Der Miniatur-Differenzvorverstärker Modell MDPA-2 ist ein 2-Kanal-Vorverstärker mit differenziellem Eingang, der für rauscharme Aufnahmen von erregbarem Gewebe ausgelegt ist. Es ist für die extrazelluläre Aufzeichnung in Verbindung mit der Implantation von implantierbaren Mikroelektroden für frei bewegliche Tieranwendungen mit dem Thomas Wireless System (TWS) vorgesehen. Der 2-Kanal-Miniatur-Differenzvorverstärker (MDPA-2) wird mit den implantierbaren Mikroelektroden verbunden, um die anfängliche zehnfache Verstärkungsstufe bereitzustellen. Idealerweise werden Thomas RECORDING Quarzglas-isolierte Platin-/Wolfram-Elektroden verwendet, um optimale Aufzeichnungsergebnisse mit hohen Signalamplituden und geringem Rauschpegel zu erzielen. Der MDPA-2 verfügt über zusätzliche gemeinsame Masse- und Referenzelektrodeneingänge.
Anschlusskabel	Thomas RECORDING GmbH	AN000330	Anschlusskabel zum Anschluss des Thomas Miniature Differentialvorverstärkers (MDPA-2) an einen Hauptverstärker und ein Akkunetzteil.
Wiederaufladbares Netzteil für den Miniatur-Vorverstärker	Thomas RECORDING GmbH	AN000328	Wiederaufladbares Akku-Netzteil für den Miniatur-Differenzvorverstärker (MDPA-2).
Akkuladegerät (US)	Thomas RECORDING GmbH	AN000167	Akkuladegerät für die Stromversorgung AN000328 (US-Netzsteckdosenanschluss)
Akkuladegerät (EU)	Thomas RECORDING GmbH	AN000168	Akkuladegerät für die Stromversorgung AN000328 (EU-Netzsteckdose)
Differenzvorverstärker/Hauptverstärker/Bandpassfilter	Thomas RECORDING GmbH	AN000677	Der TREC AC Hauptverstärker (LabAmp-03) ist ein einkanaliger, differenzieller Hauptverstärker für neurophysiologische Anwendungen (z.B. extrazelluläre Aufzeichnung mit Mikroelektroden). Dieses Instrument ist für den Einsatz mit dem Miniatur-Differenzvorverstärker Modell MDPA-2 ausgelegt. Der Einzelkanal des LabAmp-03 enthält eine rauscharme Differenzverstärkerstufe mit hoher Verstärkung, gefolgt von Niederfrequenz- und Hochfrequenzfiltern. Der Verstärker verfügt über zwei verschiedene Filterverstärker, einen SUA-Filterverstärker (Single Unit Activity) und einen LFP-Filterverstärker (Local Field Potential), die beide parallel im Signalweg geschaltet sind. Der Record-Modus bietet zwei Stufen der Signalverstärkung (x10, x100) in einer ersten Stufe und 4 zusätzliche Stufen (x5, x10, x25 und x50) in einer abschließenden Verstärkerstufe. Jeder Verstärker verfügt über unterschiedliche Bandpasscharakteristiken für Single Unit Activity (SUA) 500Hz...20kHz und Local Field Potentials (LFP) 0,1Hz...140Hz. Ein Audiomonitor und ein Fensterdiskriminator sind im Gerät integriert. Der LabAmp-03 verfügt über einen integrierten Audiomonitor mit Lautsprecher. Dieses Gerät ermöglicht die Audiowiedergabe elektrophysiologischer Signale. Das Gerät kombiniert einen Audioverstärker in einem kompakten, robusten Gehäuse. Dies eignet sich besonders zur Überwachung des neuronalen Feuerns und der Muskelkontraktionen. Der Audiomonitor-Eingang ist intern mit dem Ausgang des SUA-Filter-Verstärkers verbunden. Der LabAmp-03 wird mit einem externen Netzteil für einen Netzspannungsbereich von 100-240 V AC/50-60 Hz geliefert.
USB-Oszilloskop	Thomas RECORDING GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. Dieses 2-Kanal-PC-Oszilloskop eignet sich perfekt für den mobilen Einsatz am Laptop und die dauerhafte Installation in Schaltschränken, Industrieanlagen und vielen anderen Anwendungen, bei denen ein kleines, leichtes und leistungsstarkes Oszilloskop benötigt wird. Dieses Oszilloskop wird an den Signalausgang des Hauptverstärkers angeschlossen und dient zur Anzeige der aufgezeichneten extrazellulären Aktivität während der Implementierung der implantierbaren Mikroelektroden für das Thomas Wireless System (TWS). Der Benutzer kann die Messdaten über die verschiedenen Datenschnittstellen direkt am PC mit der mitgelieferten PC-Software erfassen.
Stimulus-Generator	Mehrkanal-Systeme	STG3008-FA	Stimulus Generator für Strom (STG) und spannungsgetriebene Stimulation erfüllen drei Funktionen: stromgetriebene Stimulation, spannungsgesteuerte Stimulation, Steuerung und Timing. Der STG ist mit 2, 4 oder 8 unabhängigen Ausgangskanälen erhältlich. Mit integrierten Isolationseinheiten für jeden Ausgangskanal ist das STG in der Lage, jede beliebige Wellenform bereitzustellen.
Kappenschutz für die Elektrode	Thomas RECORDING GmbH	AN001193	Schutzkappe für implantierbare Elektrodeneinheit für das Thomas Wireless System
Chirurgische Geräte			Schere, Zange mit stumpfem Ende, Spatel, chirurgische Haarschneidemaschine, Zahnbohrer und Wattestäbchen
Medikamente und Chemikalien			Isofluran, Xylocain, Tramadolhydrochlorid (Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Deutschland), Dexpantenol-Augensalbe (Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), 3% Wasserstoffperoxid, Povidon-Jod (Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Deutschland) und 70% Ethanol;
Befestigungsmaterial inklusive			Edelstahlschrauben (BN650 M1,2x5; 4,7 mm), Acrylharz (Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland), UV-Kleber (Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, Deutschland) und Kappenschutz (Thomas Recording GmbH, Gießen, Deutschland);
Zusätzliches Material			Handschuhe, Heizkissen, Spritzen und physiologische Kochsalzlösung.
Stereotaktisches Instrument für Kleintiere (SASI)	Thomas RECORDING GmbH	AN000287	Das Modell sollte entsprechend dem in der Studie verwendeten Tier (Ratte, Meerschweinchen, Affen usw.) ausgewählt werden
Videokamera	ImmerFokus		EverFocus, Modell: EQ150