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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Lösungen für akute Slice-Aufnahmen
- Bereiten Sie Stammlösungen von 10x künstlicher Liquorlösung (aCSF) (124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1 mM NaH2PO4 und 11 mM D-Glukose) in reinem deionisiertem Wasser vor elektrophysiologischen Experimenten vor. Die Lösung wird bei 4 °C in einer 1-Liter-Flasche ohne CaCl2 und MgCl2 gelagert.
- Bereiten Sie die Pipettenlösung auf Kaliumgluconatbasis so vor, dass sie 135 mM K-Gluconat, 1,2 mM KCl, 10 mM HEPES, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2, 4 mM MgATP, 0,4 mM Tris-GTP, 10 mM Na 2-Phosphokreatin und 2,7–7,1 mM Biocytin für die post-hoc-Offenbarung der Zellmorphologie enthält. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,3 und die Osmolarität auf 290 mOsm ein. 1 ml Aliquots bei -20 °C lagern.
>2. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung
- Übertragen Sie ein Gehirnstück, das den Hippocampus-Komplex enthält, vorsichtig mit einer speziell angefertigten Glastransferpipette in die Aufnahmekammer, die an einem aufrechten Mikroskop montiert ist. Eine Transferpipette besteht aus einer verkürzten Pasteur-Pipette (Innendurchmesser 6,5 mm), die an einem Gummipipettenkolben befestigt ist. Die Aufnahmekammer (3 ml) wird kontinuierlich mit 34 °C (erwärmtem) aCSF perfundiert, das mit 95 %/5 % O2/CO2 blasiert ist. Stellen Sie die Geschwindigkeit der Schlauchpumpe auf 2-3 ml/min ein.
- Untersuchen Sie kurz die Chronos-GFP-Expression in Axonendigungen in der interessierenden Region mit blauer LED-Beleuchtung (470 nm) und beobachten Sie mit einem 4x-Objektiv. Die GFP-Fluoreszenz wird durch einen geeigneten Emissionsfilter visualisiert, wobei ein CCD-Kamerabild auf einem Computerbildschirm angezeigt wird.
- Platzieren Sie einen Scheibenanker aus einem U-förmigen Platindraht mit eng beieinander liegenden Nylonsaiten ("Harfe") auf der Scheibe, um sie zu halten.
- Wechseln Sie zu einem 63-fach-Immersionsobjektiv und stellen Sie den Fokus ein. Suchen Sie nach Axonen, die Chronos-GFP exprimieren, und wählen Sie ein pyramidales Neuron für die Patch-Aufzeichnung.
- Verschieben Sie das Ziel nach oben.
- Ziehen Sie die Pipetten mit einem braun-flammenden Elektrodenabzieher aus Borosilikatglas. Der Abzieher ist für die Herstellung von Pipetten mit einem Spitzendurchmesser von ca. 1 μm ausgelegt. Füllen Sie die Pipetten mit einer internen Lösung auf K-Gluconat-Basis.
- Montieren Sie die Pipette in der Pipettenhalterung auf dem Kopftisch. Senken Sie die Pipette in die Kammer und suchen Sie die Spitze unter dem Objektiv. Der Pipettenwiderstand sollte zwischen 3 und 8 MΩ liegen. Üben Sie mit einer Spritze einen leichten Überdruck aus, so dass ein Kegel der Lösung aus der Pipette austritt, und senken Sie die Pipette und das Objektiv schrittweise auf die Oberfläche der Scheibe ab.
- Patchen Sie die Zelle in Voltage-Clamp-Konfiguration: Nähern Sie sich dem identifizierten Neuron und drücken Sie die Pipettenspitze vorsichtig auf das Soma. Durch den Überdruck sollte ein Grübchen auf der Membranoberfläche entstehen. Lassen Sie den Druck ab, um eine Giga-Ohm-Dichtung (>1 GΩ Widerstand) zu erzeugen. Stellen Sie nach der Versiegelung die Haltespannung auf -65 mV ein. Brechen Sie die Membran mit einem scharfen Unterdruckimpuls: Dies wird erreicht, indem ein starker Sog auf ein Röhrchen ausgeübt wird, das mit dem Pipettenhalter verbunden ist.
- Zeichnen Sie im Ganzzell-Stromzangenmodus die Reaktionen des Neurons auf hyperpolarisierende und depolarisierende Stromschritte auf (Abbildung 1A).
Anmerkung: Dieses Protokoll wird verwendet, um die aktiven und passiven intrinsischen Eigenschaften der Zelle zu bestimmen. Für die Offline-Analyse werden benutzerdefinierte MATLAB-Routinen verwendet.
- Aufzeichnung postsynaptischer Reaktionen auf die Ganzfeld-Stimulation von 475 nm LED mit 475 nm Stimulation von afferenten Fasern, die Chronos exprimieren. Stimulieren Sie mit Zügen von 10 Stimulationen von 2 ms Dauer bei 20 Hz (Abbildung 1 B, C). Die Lichtintensität kann zwischen 0,1 und 2 mW variieren
Anmerkung: Die Lichtintensität wurde mit einer digitalen optischen Handheld-Leistungskonsole gemessen, die mit einem Fotodiodensensor ausgestattet war und unter dem Objektiv positioniert war. Ansprechlatenzen von 2–4 ms sind charakteristisch für eine monosynaptische Verbindung.
