Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen tierethischen Überprüfungskommission überprüft und genehmigt.
>1. Vorbereitung von Hard- und Software für Mehrkanal-Aufnahmen
- Richten Sie ein 16-Kanal-Datenerfassungssystem nach Herstellerangaben ein.
Anmerkung: Mehrere handelsübliche Verstärker und Datenerfassungssysteme können zur Erfassung von Mehrkanalaufnahmen verwendet werden. In den hier beschriebenen Experimenten werden analoge Signale über ein Elektroden-Referenzpanel an zwei Verstärker abgegeben, wo sie verstärkt (2000x) und gefiltert (0,1-10kHz) werden. Analoge Eingänge zum Datenerfassungssystem werden mit 40 kHz digitalisiert.
- Befestigen Sie den entsprechenden 16-Kanal-Kopftischadapter an einem Mikromanipulator des Mikroskops. Richten Sie den Adapter so aus, dass die Buchsen nach unten zeigen.
- Stellen Sie den Arbeitswinkel dieses Mikromanipulators so ein, dass er in einem Winkel von ca. 70° relativ zur Horizontalen nach unten zur Aufnahmekammer ausgerichtet ist.
- Verbinden Sie den Kopftischeingang mit einer 16 x 1-Sonde für die In-vitro-Elektrophysiologie über den am Mikromanipulator verankerten Kopftischadapter.
- Verbinden Sie den Ausgangsstecker der Kopfstufe mit dem Datenerfassungssystem.
- Installieren Sie eine geeignete Software für die Datenerfassung. Konfigurieren Sie 15 Eingangskanäle so, dass sie den Eingangssignalen der ersten 15 Mehrkanal-Tastkontakte entsprechen. Konfigurieren Sie den verbleibenden Kanal so, dass er Eingaben von der intrazellulären Elektrode empfängt.
Anmerkung: Achten Sie bei der Erfassung und Analyse von Daten darauf, Elektroden- und Adapterkarten zu berücksichtigen, um sicherzustellen, dass das entsprechende Signal dem Elektrodenkontakt entspricht, von dem es erfasst wurde.
>2. Konfiguration von Lichtstimulationsprotokollen
- Richten Sie ein Lichtabgabesystem ein und installieren Sie die dazugehörige Software.
- Öffnen Sie die Software. Wählen Sie eine Hardware-Verdrahtungskonfiguration, bei der eine Trigger-Quelle (Digital/TTL (Transistor-Transistor-Logik) Out) ein Trigger-In-Signal an das Lichtabgabesystem und das Lichtabgabesystem ein Trigger-Out-Signal an eine 470-nm-LED (Leuchtdiode) liefert.
- Montieren Sie ein leistungsstarkes Objektiv. Kalibrieren Sie mit einer Digitalkamera Hochleistungsobjektive mit dem Lichtabgabesystem.
- Erstellen Sie eine neue Profilsequenz von Lichtstimulationsprofilen.
- Erstellen Sie ein Muster Ihrer Wahl. In den hier beschriebenen Experimenten ermöglicht ein Kreis mit einem Durchmesser von 150 μm die schichtspezifische Aktivierung von Axonterminalien.
- Um eine Profilsequenz zu erstellen, kopieren Sie dieses Profil und fügen Sie es für jede beliebige Anzahl von Versuchen ein.
- Erstellen Sie eine Wellenformliste, die Wellenformen beliebiger Lichtintensität, Impulsdauer oder Impulszahl enthält.
- Weisen Sie jedem Profil nach dem Zufallsprinzip Wellenformen zu. Jedes Profil mit der ihm zugewiesenen Wellenform entspricht einem Triggerimpuls von einem digitalen TTL-Eingang oder einem Versuch.
- Speichern Sie die Profilsequenz.
- Erstellen Sie in der Datenerfassungssoftware ein neues Protokoll.
- Legen Sie die Anzahl der Versuche so fest, dass sie der Anzahl der Profile in der erstellten Profilsequenz entspricht.
- Wählen Sie die Signaleingänge so, dass sie den in Schritt 1.6 konfigurierten Eingängen entsprechen. Konfigurieren Sie ein Protokoll, das einen einzelnen digitalen TTL-Ausgang bereitstellt und von diesen 16 Eingangskanälen für eine angemessene Zeit vor und nach dem digitalen Trigger aufzeichnet.
>3. Platzieren einer Mehrkanalsonde in einer ex vivo Hirngewebescheibe
- Perfundierte blasierte eACSF (Experimental Artificial cerebrospinalis liquor) (nicht in versiegelten Beuteln) bei 3-6 mL/min.
- Übertragen Sie das Hirnschnitt mit einem interessierenden Bereich auf das Netzgitter in einer Perfusionskammer des Mikroskops. Anker mit Platinharfe
- Drehen Sie das Maschengitter so, dass die Linie der Elektrodenkontakte am distalen Ende der Mehrkanalsonde ungefähr senkrecht zur Pialoberfläche verläuft.
- Senken Sie die Mehrkanalsonde unter Breitfeldbeleuchtung und Feinsteuerung des Mikromanipulators in Richtung der Oberfläche der Scheibe ab.
- Drehen Sie den Revolver des Filterwürfels, um den entsprechenden Filterwürfel zu aktivieren und das fluoreszierende Reporterprotein zu visualisieren, das in den Axonendigungen kortikaler Afferenzen exprimiert wird. Drehen Sie bei Bedarf die Scheibe, um die Sonde genauer an der Pialoberfläche auszurichten.
- Positionieren Sie die Sonde knapp über der Ebene der Schnitte, ~200 μm von der endgültigen Zielposition entlang der x-Achse entfernt, und lassen Sie mindestens einen Kanal außerhalb der Grenze des aufzuzeichnenden Gewebebereichs.
- Führen Sie die Sonde langsam in die Scheibe ein, indem Sie den Manipulator entlang seiner Längsachse bewegen. Um eine Schädigung des Gewebes zu minimieren, schieben Sie die Sonde nur so weit vor, dass die scharfen Spitzen gerade noch unter der Gewebeoberfläche sichtbar sind. Dadurch wird die Schädigung des Gewebes minimiert und gleichzeitig sichergestellt, dass die Elektrodenkontakte mit dem Gewebe in Kontakt stehen.
>4. Patch-Clamping von Zielneuronen und Erreichen der Ganzzellkonfiguration
- Wechseln Sie die eACSF-Quelle zur Kontrolllösung mit Beuteln.
- Identifizieren Sie fluoreszenzmarkierte Zellen für eine gezielte Patch-Clamp-Aufzeichnung.
- Beschränken Sie die Blendenblende der Apertur auf den kleinsten Durchmesser. Setzen Sie eine Objektivlinse mit geringer Leistung ein und bringen Sie das Gewebe in den Fokus.
- Zentrieren Sie das Licht auf einen Bereich des Gewebes, der an die Mehrkanalsonde angrenzt (diese aber nicht überlappt).
- Schalten Sie das Hochleistungs-Wasserimmersionsobjektiv (40x oder 60x) ein und achten Sie darauf, einen Kontakt zwischen der Mehrkanalsonde und der Objektivlinse zu vermeiden.
- Drehen Sie den Revolver des Filterwürfels, um den entsprechenden Filtersatz zu aktivieren und die Bildgebung von Zellen zu ermöglichen, die Cre-abhängige Fluoreszenzmarker exprimieren.
- Identifizieren Sie eine fluoreszenzmarkierte Zelle als Ziel für die Patch-Clamp-Aufzeichnung. Heben Sie die Objektivlinse an, um ausreichend Platz zum Absenken einer Patch-Pipette zu schaffen.
- Laden Sie eine Patch-Pipette (siehe Tabelle 1) mit der internen Lösung (Tabelle 2) und setzen Sie die Pipette in den Elektrodenhalter ein. Üben Sie mit einer 1-ml-Spritze einen Überdruck aus, der ~0,1 mL Luft entspricht.
- Senken Sie die Patch-Pipette in die Lösung. Bringen Sie die Pipettenspitze unter visueller Führung in den Fokus.
- Erhalten Sie eine Ganzzellaufzeichnung von der Zielzelle mit den zuvor gezeigten Schritten33.
- Wenn Sie vorhaben, Änderungen an den intrinsischen Eigenschaften der Zelle (z. B. Eingangswiderstand, Auslösepotential-Feuerrate als Reaktion auf aktuelle Schritte) zu bewerten, führen Sie diese Aufzeichnungen durch. Andernfalls fahren Sie mit dem untenstehenden Axonstimulationsprotokoll fort.
Tabelle 1: Zusammensetzung von künstlicher zerebraler Rückenmarksflüssigkeit und intrazellulärer Lösung. Reagenzien und Konzentrationen für eACSF und intrazelluläre Pipettenlösung für Patch-Clamp-Aufzeichnungen sind aufgeführt.
kg
kg
kg
kg
| Experiment ACSF, eACSF (in mM) |
| NaCl | Nr. 111 |
| NaHCO3 | 35 |
| HEPES | 20 |
| Kcl | 1,8 |
| CaCl2 | 2.1 |
| MgSO4 | 1,4 |
| KH2PO4 | 1.2 |
| Traubenzucker | 10 |
| Interne Lösung |
| K-Gluconat | 140 |
| NaCl | 10 |
| HEPES | 10 |
| EGTA (EGTA) | 0,1 |
| MgATP | 4 |
| NaGTP | 0,3 |
| pH-Wert = 7,2 |
