Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Präoperative Vorbereitungen
- Vorbereitung der Elektrodenlösung
- Um die Elektrodenfülllösung herzustellen, bereiten Sie eine Lösung aus 4 M Kaliumacetat mit 140 mM Kaliumchlorid vor.
- Vorbereitung der Elektrode
- Führen Sie mit Hilfe einer Vakuumsaugung eine T-650 Kohlefaser (7 μm Durchmesser) in eine Borosilikatglaskapillare (Länge = 100 mm, Durchmesser = 1,0 mm, Innendurchmesser = 0,5 mm) ein.
- Sobald die Kohlefaser in die Glaskapillare eingelegt wurde, platzieren Sie die Glaskapillare in einen vertikalen Elektrodenabzieher, wobei sich das Heizelement ungefähr in der Mitte der Kapillare befindet. Stellen Sie die Heizung bei ausgeschaltetem Magneten auf 55
.
- Nachdem die Kapillare gezogen wurde, heben Sie den oberen Kapillarhalter vorsichtig an, so dass die Spitze der Elektrode nicht vom Heizelement umgeben ist.
- Schneide mit einer scharfen Schere die Kohlefaser ab, die noch die beiden Teile der Kapillare verbindet. Das Ergebnis sind zwei separate Kohlefaser-Mikroelektroden.
- Schneiden Sie unter einem Lichtmikroskop die freiliegende Kohlefaser vorsichtig mit einem scharfen Skalpell so ab, dass sie etwa 75-100 μm über das Ende des Glases hinausragt.
- Stellen Sie mit einem Lichtmikroskop sicher, dass die Elektrode entlang der Kapillare frei von Rissen ist und dass die Dichtung, an der die Kohlefaser aus der Kapillare austritt, schwer zu erkennen und frei von Rissen ist.
Anmerkung: Eine gute Abdichtung trägt dazu bei, das Rauschen während der Aufnahmen zu reduzieren.
- Herstellung von Referenzelektroden
- Löten Sie eine Goldnadel an einen 5 cm langen Silberdraht.
- Befestigen Sie die Anode an einer Büroklammer oder einem anderen Leiter, die Kathode an einem Stift und legen Sie eine Spannung (~2 V) an, während die Büroklammer und der Silberdraht in 0,1 M HCl eingetaucht sind.
- Stoppen Sie die Spannung, sobald eine weiße Beschichtung (AgCl) auf dem Silberdraht erscheint.
- Elektroden für die Implantation vorbereiten
- Löten Sie einen Goldstift an einen dünnen isolierten Draht (~10 cm Länge, <0,50 mm Durchmesser).
- Entfernen Sie ~5 cm Isolierung von dem Draht, der dem Goldstift gegenüberliegt.
- Füllen Sie die Elektrode etwa zur Hälfte mit der Elektrodenlösung.
- Isolierten Draht in die Elektrode einführen.
Anmerkung: Der Draht sollte Kontakt mit der Kohlefaser im Inneren der Elektrode haben.
2. Elektrodenimplantationen
- Geben Sie erwachsenen, männlichen Sprague-Dawley-Ratten (250-450 g) eine intraperitoneale Injektion (1,5 g/kg oder 1 ml/kg Volumen) von 0,5 g/ml Urethan, gelöst in steriler Kochsalzlösung. Beginnen Sie mit einer anfänglichen Urethandosis von 1,0-1,2 g/kg. Wenn das Tier 20 Minuten nach der Urethanverabreichung immer noch auf den schädlichen Stimulustest (Schwanzkneifen) anspricht, verabreichen Sie zusätzlich 0,3-0,5 g/kg Urethan für eine Gesamtdosis von 1,5 g/kg.
Anmerkung: Um die 0,5 g/ml-Urethanlösung herzustellen, fügen Sie 10 g Urethan zu 10 g (~10 mL) Kochsalzlösung hinzu. Urethan ist krebserregend und muss mit Vorsicht behandelt werden. Es ist jedoch ein wichtiges Anästhetikum, da es den Dopaminspiegel nicht verändert, wie es bei anderen Anästhetika wie Ketamin/Xylazin und Chloralhydrat der Fall ist.
- Sobald das Tier tief betäubt ist und nicht auf schädliche Reize reagiert (z. B. Zehenkneifen), platzieren Sie es in den stereotaktischen Rahmen. Tragen Sie ophthalmisches Gleitmittel auf jedes Auge der Ratte auf.
Anmerkung: Dies ist eine Operation, die nicht überleben kann, aber eine gute aseptische Technik wird empfohlen.
- Reinigen Sie die Kopfhaut der Ratte mit einem zweistufigen Peeling (d. h. einem Jodopovidon-Peeling, gefolgt von einem 70%igen Ethanol-Peeling; führen Sie es mit einer 3-Zyklus-Wiederholung durch).
- Schneiden Sie das Kopfhautgewebe mit einer sterilisierten Nadelpinzette und einer chirurgischen Schere ab. Entfernen Sie eine beträchtliche Menge Gewebe, um Platz für die verschiedenen Implantationen zu schaffen, die unten beschrieben werden.
- Reinige die Schädeloberfläche vorsichtig mit sterilisierten Wattestäbchen-Applikatoren. Tragen Sie dann 2-3 Tropfen 3%iges Wasserstoffperoxid auf, um das Lambda und Bregma zu identifizieren.
- Bohren Sie mit einem stereotaktischen Bohrer oder Handbohrer (1,0 mm, ~20.000 U/min) ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, 2,5 mm vor dem Bregma und 3,5 mm lateral des Bregmas. Implantieren Sie teilweise (etwa zur Hälfte, bis sie fest sitzt) eine Schraube (1,59 mm Außendurchmesser, 3,2 mm lang) in dieses Loch. Es wird empfohlen, sterile Kochsalzlösung zur Bewässerung während des Bohrens zu verwenden, um thermische Verletzungen zu vermeiden.
- Bohren Sie für die Referenzelektrode ein Loch mit einem Durchmesser von 1,0 mm, 1,5 mm vor und 3,5 mm lateral des Bregmas, in der linken Hemisphäre.
- Führen Sie ~2 mm Referenzdraht von Hand in dieses Loch ein, während Sie den Referenzdraht um und unter den Kopf der implantierten Schraube wickeln.
- Implantieren Sie die Schraube vollständig und befestigen Sie die Referenzelektrode an Ort und Stelle.
- Bohren Sie in der rechten Hemisphäre ein Loch mit einem Durchmesser von 1,5 mm, 1,2 mm vor und 1,4 mm lateral des Bregmas.
- Entfernen Sie die Dura vorsichtig mit einer Pinzette.
- Für die Stimulationselektrode bohren Sie ein quadratisches Loch (2 mm anterior-posterior, 5 mm medial-lateral), das 5,2 mm posterior und 1,0 mm lateral zum Bregma zentriert ist.
- Senken Sie die bipolare Stimulationselektrode/Führungskanüle mit den stereotaktischen Armstangen 5 mm unter die Dura ab. Im Falle von Blutungen während der Implantation der Elektrode verwenden Sie sterile Wattestäbchen und Gaze, um die Blutung zu minimieren.
Anmerkung: Die bei dieser Methode verwendete bipolare Stimulationselektrode ist mit einer Führungskanüle vorgerüstet (Materialtabelle). Die mit diesem Artikel verwendete interne Kanüle sollte mit den Zinken der bipolaren Stimulationselektrode gespült werden, wenn sie vollständig in die Führungskanüle eingeführt wird. Auf diese Weise kann die innere Kanüle direkt zwischen den beiden Zacken des Stimulators sitzen, die etwa 1 mm voneinander entfernt sitzen. Ein ähnliches Protokoll wird an anderer Stelle beschrieben.
- Senken Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode mit den stereotaktischen Armstangen 4 mm unter die Dura ab. Diese Stelle befindet sich im dorsalen Teil des Striatums.
- Verbinden Sie den Referenzdraht und die Kohlefaser mit einem Potentiostaten.
- Wenden Sie eine dreieckige Wellenform (-0,4−1,3 V, 400 V/s) für 15 min bei 60 Hz und erneut 10 min bei 10 Hz an.
Anmerkung: Typischerweise werden beim Auftragen von Wellenformen auf Kohlefaser-Mikroelektroden im Gehirn Oxidgruppen an die Oberfläche der Kohlefaser angehängt. Das Gleichgewicht dieser Reaktion muss vor der Aufzeichnung erreicht werden; Andernfalls kommt es zu einer erheblichen Drift19. Wenn die Elektrode bei höheren Frequenzen (60 Hz) zyklisch geschaltet wird, kann die Kohlefaser schneller ins Gleichgewicht kommen.
>3. Optimierung der Kohlefaser und Stimulation der Positionen der Elektroden-/Führungskanülen
- Stellen Sie den Stimulator so ein, dass er eine bipolare elektrische Wellenform mit einer Frequenz von 60 Hz, 24 Impulsen, 300 μA Strom und einer Impulsbreite von 2 ms/Phase erzeugt.
- Senken Sie den Stimulator vorsichtig in Schritten von 0,2 mm von 5 mm bis 7,8 mm unter die Dura ab. Stimulieren Sie bei jedem Inkrement den VTA.
Anmerkung: Bei tieferen dorsalen Tiefen (5-6 mm) führt die Stimulation des Gehirns typischerweise (~80% der Zeit) dazu, dass die Schnurrhaare der Ratte zucken. In weiteren Tiefen hören die Schnurrhaare auf zu zucken, was zwischen 7,5 und 8,2 mm unterhalb der Dura auftritt. Wenn die Schnurrhaare aufhören zu zucken, befindet sich die Stimulationselektrode in der Nähe oder am VTA. Dies tritt nicht bei jeder Ratte auf, und das Fehlen von Schnurrhaarzucken sollte nicht als Zeichen dafür gewertet werden, dass die bipolare Stimulationselektrode/Infusionskanüle falsch platziert ist. Whisker-Zuckungen treten möglicherweise nicht bei allen Anästhetika (z. B. Isofluran) auf.
- Senken Sie die bipolare Stimulationselektrode/Führungskanüle weiter ab, bis eine Stimulation eine phasische DA-Freisetzung an der Kohlefaser-Mikroelektrode (derzeit im dorsalen Striatum) erzeugt.
Anmerkung: Die DA-Freisetzung im dorsalen Striatum tritt nicht immer auf, wenn die bipolare Elektrode in das VTA implantiert wird, aber die Beobachtung der DA-Freisetzung im dorsalen Striatum nach VTA-Stimulation ist in der Regel ein gutes Zeichen dafür, dass ein gutes Signal im NAc-Kern beobachtet wird.
- Senken Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode ab, bis sie mindestens 6,0 mm unter der Dura liegt. Dies ist der dorsalste Teil des NAc-Kerns.
- Stimulieren Sie den VTA und zeichnen Sie die Spitzenamplitude des DA-Peaks auf.
- Senken oder heben Sie die Kohlefaser-Mikroelektrode an der Stelle ab, die die größte DA-Freisetzung erzeugt.
- Stellen Sie sicher, dass die DA-Ansprechspitze eine klare Oxidationsspitze bei 0,6 V und eine Reduktionsspitze bei -0,2 V ist. Diese Spitzen weisen auf DA hin.
>4. Kombinierte Infusion und Stimulation FSCV-Aufzeichnung
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Zeitleiste für die Aufzeichnung vor und nach der VTA-Mikroinfusion.
- Sobald die Position der Kohlefaser und der Stimulationselektrode/Führungskanüle optimiert wurde, stimulieren Sie für ~20-30 min.
Anmerkung: Unter den aktuellen Stimulationsparametern sollten Sie nicht mehr als einmal alle 3 Minuten stimulieren, um ein vesikuläres Nachladen zu ermöglichen22.
- Nachdem Sie eine stabile Ausgangsbasis erreicht haben (<20 % Variation über fünf Stimulationen), senken Sie die innere Kanüle vorsichtig von Hand in die Führungskanüle ab, die in den bipolaren Stimulator eingesetzt ist.
- Nehmen Sie zusätzlich 2-3 Basisaufnahmen vor, um sicherzustellen, dass das Kanüleneinführen selbst das evozierte Signal nicht verändert hat. In einigen Fällen kann das Einführen und Entfernen der internen Kanüle die VTA beschädigen. Wenn sich das Signal über diesen Basiszeitraum (>20%) drastisch ändert, führen Sie weitere 3-4 Aufnahmen durch, bis sich die Basislinie wieder stabilisiert.
- Mit einer Spritzenpumpe und einer Mikrospritze 0,5 μl Lösung (z. B. 0,9 % Kochsalzlösung, N-Methyl-D-aspartat [NMDA], (2R)-amino-5-phosphonovaleriansäure [AP5]) über einen Zeitraum von 2 Minuten in das VTA infundieren.
- Lassen Sie die innere Kanüle nach der Infusion mindestens 1 Minute vor der Entnahme stehen.
Anmerkung: Bei einigen Arzneimitteln kann es erforderlich sein, die innere Kanüle aufgrund der Arzneimittelkinetik für eine längere Zeit zu verlassen, und das Entfernen der inneren Kanüle kann dazu führen, dass das Arzneimittel durch die innere Kanüle wieder nach oben wandert. Wenn Bedenken bestehen, könnte man die Innenkanüle während der gesamten Aufnahme in der Führungskanüle belassen. Andernfalls kann die Aufzeichnung nach diesem 1-Minuten-Intervall beginnen.
- Nehmen Sie alle 3 Minuten auf, um die Wirkung nach der Infusion zu messen.
Anmerkung: Wenn eine Kontrolllösung infundiert wird und keine Wirkung beobachtet wird, ist es möglich, ein zweites Mal zu infundieren10. Wenn es zu einer veränderten DA-Freisetzung kommt, die durch das Einführen der internen Kanüle oder der Kochsalzinfusion verursacht wird, kehrt das Signal in der Regel innerhalb von 30 Minuten auf den Ausgangswert zurück.
