Bestimmung einer Test-Wachstumshormon-Wirkung auf Kisspeptin-Neuronen mit einer Ganzzell-Patch-Klemme

Zusammenfassung

Quelle: Silva, J. d. N., et al., Hypothalamische Kisspeptin-Neuronen als Ziel für Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. J. Vis. Exp. (2023)

Dieses Video zeigt die Verwendung der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik zur Messung von Reaktionen in Kisspeptin-Neuronen aus transfizierten Hypothalamusschnitten der Maus. Der Prozess umfasst das Erreichen einer Ganzzellkonfiguration und die Aufzeichnung von Veränderungen des Membranpotenzials, die durch das Testhormon im Strom-Clamp-Modus induziert werden.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Zellversiegelung für die Aufzeichnung

1. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte (Mikroskop, Verstärker, Digitalisierer, Mikromanipulator und andere) eingeschaltet sind, bevor Sie mit der Aufnahme beginnen.
2. Füllen Sie die Aufnahmekammer einer kommerziellen Marke (Table of Materials) und befestigen Sie sie mit der aCSF-Lösung für Aufnahmen am Mikroskop. Verwenden Sie eine Perfusionspumpe, um den aCSF konstant mit einer Rate von 2 mL/min zu perfundieren.
3. Übertragen Sie ein interessiertes Gehirnstück (nacheinander) in die Aufnahmekammer. Verwenden Sie eine Acryl-Transferpipette (invertierte Pasteur-Glaspipette, die an einem Silikonsauger befestigt ist), um die Hypothalamusscheiben in die Kammer zu übertragen. Verwenden Sie einen Schichtanker (Materialtabelle), um die Scheibe so zu halten, dass sie sich während der aCSF-Perfusion nicht bewegt.
4. Platzieren Sie eine Scheibe in der Mitte der Aufnahmekammer, die am Mikroskop befestigt ist. Die Position der Scheibe ist entscheidend, um eine gute Sicht auf die gewünschte Region unter dem Mikroskop zu ermöglichen und eine perfekte Reichweite der aufnehmenden Mikropipette zu gewährleisten.
5. Verwenden Sie die stromsparende Objektivlinse eines Immersionsmikroskops (10x oder 20x), um die Positionierung der Scheibe und die Lokalisierung des interessierenden Bereichs zu unterstützen.
6. Nachdem Sie die interessierende Region lokalisiert haben, schalten Sie die Objektivlinse auf die Hochleistungslinse (63x) und fokussieren Sie auf die Gewebeebene, wobei Sie das endogene fluoreszierende Protein und die Formen der Zellen in der Zielregion beobachten, um die Kisspeptin-Zellen auf der Oberfläche des Gehirnschnitts zu lokalisieren.
7. Wenn sich eine mögliche Zielzelle befindet, markieren Sie sie auf dem Computerbildschirm mit dem Mauszeiger oder indem Sie ein Format, wie ein Quadrat, über den interessierenden Bereich zeichnen. Die Bildschirmmarkierung des Computers hilft dabei, die Position der Aufzeichnungsmikropipette zur Zelle zu leiten.
8. Nachdem Sie die genaue Position der Zielzelle bestimmt haben, heben Sie das Objektiv an und führen Sie die mit der internen Lösung gefüllte Mikropipette ein. Wenn Sie die Mikropipette in den Elektrodenhalter einsetzen, stellen Sie sicher, dass die innere Lösung mit der Silberelektrode in Kontakt kommt.
   Anmerkung: Für die Vorbereitung, Platzierung und Positionierung von Mikropipetten auf dem Elektrodenhalter.
9. Üben Sie vor dem Eintauchen der Mikropipette in die aCSF-Lösung einen Überdruck aus, um das Eindringen von Schmutz in die Mikropipette zu verhindern, indem Sie eine luftgefüllte Spritze von 1-3 mL verwenden, die über einen Polyethylenschlauch (≈130 cm länger) mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist. Tragen Sie fast 100-200 μl Luft auf.
10. Führen Sie die Mikropipette mit dem Mikromanipulator unter die Mitte des Objektivs. Bewegen Sie die Tasten am Mikromanipulator, um die Mikropipette auf der X-Y-Z-Achse in Richtung der gewünschten Zelle zu führen.
11. Passen Sie den Fokus so an, dass die Spitze der Mikropipette zu sehen ist, und bringen Sie den Fokus näher, aber nicht zu nahe an die Scheibe. Verringern Sie die Geschwindigkeit des Mikromanipulators und senken Sie die Mikropipette langsam auf die Fokusebene ab. Achten Sie darauf, dass die Spitze der Mikropipette nicht abrupt in die Scheibe eindringt, sondern langsam absinkt, bis sie die Oberfläche der Zelle/Zielregion berührt.
12. Üben Sie mit der luftgefüllten 1-3-ml-Spritze, die an der Mikropipettenhalterung befestigt ist, einen leichten Überdruck (≈100 μl) aus, um Schmutz aus dem Zuflugweg zu entfernen.
13. Fokussieren Sie sich auf die Zielzelle und bewegen Sie den Mikromanipulator langsam auf der X-Y-Z-Achse, um die Mikropipette näher an sie heranzuführen. Beim Berühren der Mikropipette mit der Zelle wird ein Grübchen beobachtet, das durch den durch die Mikropipettenspitze ausgeübten Druck verursacht wird (Abbildung 2C).
14. Nachdem Sie das Grübchen gebildet haben, üben Sie aufgrund der Nähe der Mikropipette zur Zelle einen schwachen, kurzen Sog mit dem Mund (1-2 s) durch das Röhrchen aus, das mit dem Mikropipettenhalter verbunden ist, um die Dichtung zwischen der Mikropipette und der Zelle zu erzeugen (Gigaohm-Dichtung oder Gigaseal >1 GΩ; Abbildung 2D). Um die Dichtung zu bilden, verwenden Sie den Voltage-Clamp-Modus in der Software.
15. Wenn die Dichtung stabil bleibt (die Gigaohm-Dichtung sollte mechanisch stabil und ohne Rauschstörungen sein, bestimmt durch Beobachtung für ca. 1 min), stellen Sie die Haltespannung auf das nächstgelegene physiologische Ruhepotential der interessierenden Zelle ein. Für Kisspeptin-Hypothalamus-Neuronen wird -50 mV empfohlen.
16. Üben Sie ein kurzes Saugen mit dem Mund (Unterdruck) aus, wobei die Mikropipette mit der Zelle versiegelt ist, um die Plasmamembran zu durchbrechen (Abbildung 2E). Eine adäquate Ganzzellkonfiguration wird erreicht, wenn die Absaugung mit ausreichender Kraft durchgeführt wird, so dass die gerissene Membran die Mikropipette nicht verstopft und keinen beträchtlichen Teil der Membran oder sogar der Zelle anzieht.
17. Überprüfen Sie die manuell verwendeten Systemeinstellungen. Verwenden Sie die Software (siehe Materialtabelle), um den Serienwiderstand (SR) und die Ganzzellkapazität (WCC) digital zu überprüfen und zu berechnen.
18. Aktivieren Sie im Voltage-Clamp-Modus nach dem Aufbrechen der Zellmembran die Option für die gesamte Zelle und klicken Sie auf den Befehl Auto, der sich auf die Registerkarte der gesamten Zelle bezieht. Die SR und WCC der Zelle werden automatisch berechnet und sofort von der Software angezeigt. Diese Parameter können auch überprüft werden, indem der Membrantest mit dem in der Materialtabelle genannten Verstärker durchgeführt wird.
19. Stellen Sie sicher, dass Sie die Parameter für die Zellviabilität überprüfen. Bei Kisspeptin-Neuronen ist zu überprüfen, ob die elektrophysiologischen Messungen wie folgt lauten: SR < 25 mΩ, Eingangswiderstand > 0,3 GΩ und Absolutwert des Haltestroms < 30 pA. Der Mittelwert des WCC von AVPV/PeNKisspeptin- oder ARHkisspeptin-Neuronen liegt bei ≈ 10-12 pF in gonadintakten Mäusen.
20. Überwachen Sie die SR und die stationäre Kapazität der Zelle während der Experimente. Stellen Sie sicher, dass sich die SR während einer Aufzeichnung nicht um mehr als 20 % ändert und dass die Membrankapazität stabil ist.
21. Überprüfen Sie die Softwareeinstellungen. Erstellen Sie je nach Art des Experiments spezifische Protokolle für die Aufzeichnungen. Um das Membranpotential im Stromzangenmodus mit den in der Materialtabelle genannten Geräten aufzuzeichnen, filtern Sie die elektrophysiologischen Signale bei 2-4 kHz und analysieren Sie die Ergebnisse offline in der Software (Informationen zur Software finden Sie in der Materialtabelle).
22. Sobald die Ganzzellenkonfiguration richtig erreicht ist, messen Sie die synaptischen Ströme im Voltage-Clamp-Modus (Abbildung 2G). Aufzeichnung von Änderungen des Ruhemembranpotentials (RMP) und induzierten RMP-Variationen im Stromzangenmodus (Abbildung 2H). Veränderungen des RMP, wie z. B. eine Depolarisation der Zellmembran, können durch Verabreichung eines bekannten Arzneimittels/Neurotransmitters an das Bad induziert werden (beschrieben in Schritt 1.2), wie in Abbildung 1.
    dargestellt Anmerkung: Im Stromzangenmodus kann positiver oder negativer Strom eingespeist werden, um die Membranspannung auf einer gewünschten Spannung zu halten. Für Kisspeptin-Neuronen setzen wir normalerweise die Nullstrominjektion (I = 0), um die spontane Variation des Membranpotentials aufzuzeichnen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung, die den Beitrag der Ganzzell-Patch-Clamp-Technik zum Wissen über die Aktivität der Kisspeptin-Neuronen zusammenfasst. Die Kisspeptin-Neuronen (grün dargestellt) befinden sich in den anteroventralen periventrikulären und rostralen periventrikulären Kernen (AVPV/PeN) und im Nucleus arcuatus des Hypothalamus (ARH). Die AVPV/PeNKisspeptin- und AR...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Compounds für aCSF, interne und Slicing-Lösungen
Atp	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. A9187
Calciumchlorid	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. C7902
D-(+)-Glukose	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. G7021
EGTA (EGTA)	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. O3777
HEPES	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. H3375
Kcl	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. P5405
K-Gluconat	Sigma Aldrich/Verschiedenes	G4500
Koh	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. P5958
Magnesiumchlorid	Sigma Aldrich/Verschiedenes	M9272
Magnesiumsulfat	Sigma Aldrich/Verschiedenes	230391
NaCl	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. S5886
Mononatriumphosphat	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. S5011
Natriumbicarbonat	Sigma Aldrich/Verschiedenes	Nr. S5761
Ausrüstungen
Verstärker	Molekulare Bauelemente	Multiclamp 700B
DIGIDATA 1440 GERÄUSCHARMES DATENERFASSUNGSSYSTEM	Molekulare Bauelemente	DD1440
Digitale Schlauchpumpe	Ismatec	ISM833C
Faradayscher Käfig	TMC (Englisch)	Artikel-Nr.: 81-333-03
Bildgebende Kamera	Leica	DFC 365 FX
Mikromanipulator	Sutter Instrumente	Roe-200
Mikropipetten-Abzieher	Narishige	PC-10
Mikroskop	Leica	DM6000 FS
Rückgewinnungskammer	Warner Instruments/Harvard-Apparatur	-
Aufnahmekammer	Warner Instruments	640277
Spatel	Fisher Scientific /verschiedenes	FISCH-14-375-10; FISCH-21-401-20
Software und Systeme
AxoScope 10 Software	Molekulare Bauelemente	-	Commander-Software
LAS X Weitfeldsystem	Leica	-	Bilderfassung und -analyse
MultiClamp 700B	Molekulare Bauelemente	MULTICLAMP 700B	Commander-Software
PCLAMP 10 SOFTWARE FÜR WINDOWS	Molekulare Bauelemente	Pclamp 10 Standard
Werkzeuge
Ag/AgCl-Elektrode, Pellet, 1,0 mm	Warner Instruments	Nr. 64-1309
Slice-Anker	Warner Instruments	Tel.: 64-0246