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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. In-vitro-Elektrophysiologie
- Aufbereitung von Lösungen für die Präparation und Aufzeichnung von Rückenmarksschnitten
- Künstlicher Liquor
Anmerkung: Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) wird in einer Grenzflächeninkubationskammer verwendet, in der die Scheiben bis zum Beginn der Aufzeichnung und während der Experimente sowohl als Perfusat als auch als Verdünnungsmittel für Medikamente aufbewahrt werden. Siehe Tabelle 1 für die detaillierte Zusammensetzung.
- Bereiten Sie aCSF zu, das (in mM) 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 Glukose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 und 2,5 CaCl2 enthält, indem Sie die erforderlichen Mengen der oben genannten Mengen, ausgenommen CaCl2, zu 2 l destilliertem Wasser hinzufügen.
- Blasen Sie die obige Lösung 5 min lang mit Carbogen (95% O2, 5% CO2) und fügen Sie CaCl2.
Anmerkung: Dieser Schritt verhindert die Ausfällung von CaCl2, d.h. die Lösung sollte nicht trüb werden. Für die Anwendung des Arzneimittels während der Experimente verdünnen Sie die Stammlösungen des Arzneimittels in aCSF auf die gewünschten Endkonzentrationen.
>2. Saccharose-substituierte künstliche Zerebrospinalflüssigkeit
HINWEIS: Saccharose-substituiertes aCSF wird während der Dissektion und des Rückenmarksschnitts verwendet. Wie der Name schon sagt, wird NaCl durch Saccharose substituiert, um die neuronale Erregung während dieser Verfahren zu reduzieren und gleichzeitig die Osmolarität aufrechtzuerhalten. Siehe Tabelle 1 für die detaillierte Zusammensetzung.
- Bereiten Sie saccharosesubstituiertes aCSF zu, das (in mM) 250 Saccharose, 25 NaHCO3, 10 Glucose, 2,5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 und 2,5 CaCl2 enthält, indem Sie die erforderlichen Mengen aller oben genannten Stoffe, ausgenommen CaCl2, zu 300 ml destilliertem Wasser hinzufügen.
- Die Lösung 5 min mit Carbogen sprudeln lassen und dann CaCl2 hinzufügen.
- Lagern Sie die Lösung ca. 40 Minuten lang in einem Gefrierschrank bei -80 °C oder bis die Lösung eine Aufschlämmung bildet. Vermeiden Sie das Einfrieren von Feststoffen und verwenden Sie sie in der Konsistenz der Gülle.
>3. Vorbereitung des Mikroelektrodenarrays
HINWEIS: Die Kontaktfläche des MEA erfordert eine Vorbehandlung, um sie hydrophil zu machen.
- Füllen Sie die MEA-Vertiefung vor dem Experiment 30 Minuten lang entweder mit fötalem Rinderserum (FBS) oder Pferdeserum (HS).
- Entfernen Sie das FBS oder HS und spülen Sie MEA gründlich mit ca. fünf Wäschen destilliertem Wasser aus, bis das destillierte Wasser nicht mehr schäumt. Füllen Sie die Vertiefung mit aCSF, gebrauchsfertig.
>4. Präparation von akuten Rückenmarksschnitten
- Betäuben Sie die Maus tief mit 100 mg/kg Ketamin (i.p.) und enthaupten Sie sie dann mit einer großen chirurgischen Schere.
- Entfernen Sie die Haut über der Bauchregion, indem Sie einen kleinen Schnitt in die Haut auf Höhe der Hüften machen. Ziehen Sie die Haut auf beiden Seiten des Schnitts rostral, bis die gesamte Haut entfernt ist, d.h. von der Oberseite des Brustkorbs bis zur Oberseite des Beckens (sowohl ventral als auch dorsal).
- Legen Sie den Körper auf Eis und verwenden Sie einen ventralen Ansatz, um die Wirbelsäule freizulegen, indem Sie alle Eingeweide entfernen und die Rippen seitlich des Brustbeins durchschneiden.
- Entfernen Sie den ventralen Brustkorb, beide Schulterblätter (abgeschnitten bei etwa T2) sowie die unteren Gliedmaßen und das Becken (etwa am oberen Ende des Kreuzbeins abgeschnitten).
- Die Wirbelsäule und die Rippenvorbereitung werden in ein Präparierbad mit eiskalter Saccharose aCSF überführt. Stecken Sie alle vier Ecken des Präparats (Bauchfläche nach oben), indem Sie Stecknadeln durch die unteren Rückenmuskeln und die daran befestigten oberen Rippen platzieren.
Entfernen - Sie sämtliches Muskel- und Bindegewebe über der ventralen Oberfläche der Wirbel mit Rongeuren und identifizieren Sie die Wirbelregion über der lumbosakralen Vergrößerung, die etwa unterhalb der Wirbelkörper T12 bis L2 liegt.
- Entfernen Sie einen Wirbelkörper, der kaudal zur lumbosakralen Vergrößerungsregion liegt, um Zugang zum Rückenmark zu erhalten, während es im Wirbelkanal sitzt.
- Schneiden Sie mit einer gebogenen Federschere beidseitig durch die Wirbelstiele, während Sie den Wirbelkörper rostral anheben und ziehen, um die ventralen und dorsalen Aspekte der Wirbel zu trennen und das Rückenmark freizulegen.
- Nachdem die Wirbelkörper entfernt wurden, um die lumbosakrale Vergrößerung freizulegen, entfernen Sie vorsichtig die verbleibenden Wurzeln, die das Rückenmark verankern, mit einer Federschere, bis das Rückenmark frei schwimmt.
- Isolieren Sie das Rückenmark mit rostralen und kaudalen Schnitten weit über und unter der lumbosakralen Vergrößerung, so dass die Zielregion des Rückenmarks "frei schweben" kann.
Anmerkung: Die bevorzugte Scheibenausrichtung bestimmt, wie die Schnur anschließend für das Schneiden montiert wird (Abbildung 1).
- Bei Querschnitten heben Sie das lumbosakrale Segment an einer befestigten Wurzel an und legen es auf einen vorgeschnittenen Block aus Polystyrol (Styropor) (1 cm x 1 cm x 1 cm) mit einem flachen Kanalschnitt in der Mitte. Den Block und die Schnur mit Cyanacrylatkleber (siehe Materialtabelle) an der Trennplattform befestigen und in das Schneidbad mit eiskalter Saccharose aCSF (Slurry) legen.
Anmerkung: Der flache Kanal hilft, das Rückenmark zu sichern und auszurichten, wobei die dorsale Seite freiliegt und das thorakale Ende des Rückenmarks am unteren Ende des Blocks liegt.
- Für sagittale Schnitte legen Sie eine dünne Linie Cyanacrylatkleber auf die Schnittplattform, heben Sie die lumbosakrale Vergrößerung an einer befestigten Wurzel an und platzieren Sie die Schnur entlang der Klebelinie, wobei Sie sicherstellen, dass eine Seitenfläche im Kleber und die andere nach oben zeigt. Legen Sie es in das Schneidbad mit eiskalter Saccharose aCSF (Gülle).
- Für horizontale Scheiben tragen Sie eine dünne Linie Cyanacrylatkleber auf die Trennplattform auf. Heben Sie die lumbosakrale Vergrößerung an einer befestigten Wurzel an und platzieren Sie die lumbosakrale Vergrößerung entlang der Adhäsionslinie, wobei Sie sicherstellen, dass die ventrale Oberfläche im Klebstoff liegt und die dorsale Oberfläche nach oben zeigt. Verwenden Sie angebrachte Wurzeln, um das Kabel zu positionieren. Legen Sie es in das Schneidbad mit eiskalter Saccharose aCSF (Gülle).
>5. Mikroelektrodenarray-Aufzeichnungen
HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben, wie Datensatzdaten aus MEA-basierten Experimenten an Rückenmarksschnitten verwendet werden. Je nach Experiment können mehrere MEA-Designs verwendet werden. Details zum Design der in diesen Experimenten verwendeten MEAs sind in Tabelle 2 und Abbildung 2 dargestellt. Egert et al. und Thiebaud et al. haben detaillierte Designinformationen für planare bzw. 3-dimensionale (3D) MEAs veröffentlicht. Beide MEA-Typen bestehen aus 60 Titannitrid-Elektroden mit einer Siliziumnitrid-Isolierschicht sowie Titannitrid-Bahnen und -Kontaktpads.
- Versuchsaufbau
- Schalten Sie den Computer und die Schnittstellenplatine ein und starten Sie die Aufnahmesoftware.
- Laden Sie die vormontierte Aufnahmevorlage (Abbildung 3A). Benennen Sie die Dateien für den Tag auf der Registerkarte Rekorder.
- aCSF mit Carbogen (5 % CO2, 95 % O2) für die Dauer des Experiments kontinuierlich blasen.
- Schalten Sie das Perfusionssystem ein, das von einer Schlauchpumpe gesteuert wird. Legen Sie die Einlaufleitung in aCSF und das Einlaufende in ein Abfallbecherglas. Grundieren Sie die Perfusionslinien mit aCSF.
- Bereiten Sie 4-AP und alle anderen Arzneimittellösungen vor, indem Sie die Brühen in 50 mL aCSF auf die erforderliche Endkonzentration verdünnen (z. B. 200 μM für 4-AP).
- 4-Aminopyridin (4-AP) Aktivität
- Nach der Inkubation wird eine einzelne Scheibe aus dem Inkubator mit einer mit aCSF gefüllten Pasteur-Pipette mit großer Spitze übertragen.
- Legen Sie die Scheibe in die MEA-Vertiefung und fügen Sie zusätzlichen aCSF hinzu.
- Positionieren Sie die Scheibe mit einem feinen Kurzhaarpinsel über dem 60-Elektroden-Aufnahmearray. Vermeiden Sie es, die Elektroden mit dem Pinsel zu berühren oder das Gewebe über die Elektroden zu ziehen, insbesondere bei der Verwendung von 3D-Arrays.
Anmerkung: Je nach MEA-Layout kann dies mit oder ohne Hilfe eines Mikroskops erfolgen, um eine genaue Positionierung zu gewährleisten.
- Legen Sie nach dem Positionieren der Scheibe ein beschwertes Netz über das Gewebe, um es an Ort und Stelle zu halten und einen guten Kontakt mit den MEA-Elektroden zu fördern.
Anmerkung: Möglicherweise muss die Scheibe nach der Netzplatzierung neu positioniert werden.
- Platzieren Sie den MEA in der Aufnahmekopfbühne (Abbildung 2A, B).
- Überprüfen Sie die Position des Gewebes über den Elektroden mit einem inversen Mikroskop (2-fache Vergrößerung), um sicherzustellen, dass sich möglichst viele Elektroden unter dem oberflächlichen Hinterhorn (SDH) befinden. Stellen Sie sicher, dass mindestens 2-6 Elektroden die Scheibe nicht berühren, da diese Elektroden wichtig sind, um Rauschen zu subtrahieren und Artefakte während der Analyse aufzuzeichnen (Abbildung 2E).
- Schalten Sie die Kamera ein, schließen Sie sie an das Gerät an, und nehmen Sie ein Referenzbild des Schichts relativ zum MEA auf, um es während der Analyse zu verwenden.
- Drücken Sie in der Aufzeichnungssoftware auf Start DAQ (Datenerfassung) und vergewissern Sie sich, dass alle Elektroden ein klares Signal empfangen.
Anmerkung: Wenn das Signal verrauscht ist, lösen Sie den Kopftisch und reinigen Sie sowohl die MEA-Kontaktpads als auch die Goldfederkontakte mit 70 % Ethanol (verwenden Sie ein Labortuch, um sicherzustellen, dass die Pads und Kontakte nach der Reinigung trocken sind). Wenn das Signal immer noch verrauscht ist, schalten Sie die fehlerhaften Elektroden in der Aufzeichnungssoftware aus oder notieren Sie sich für den Ausschluss später während der Analyse.
- Befestigen Sie die Perfusionsein- und -auslassleitungen an der MEA-Vertiefung (zuvor mit aCSF gefüllt) und schalten Sie das Perfusionssystem ein. Überprüfen Sie die Durchflussmenge, idealerweise 4-6 Badvolumina pro Minute, und stellen Sie sicher, dass der Abfluss ausreicht, um ein Überlaufen des Superfusats zu verhindern.
- Lassen Sie das Gewebe 5 Minuten lang äquilibrieren und zeichnen Sie dann 5 Minuten rohe, ungefilterte Basisdaten auf.
- Bewegen Sie die Perfusionseinlassleitung von aCSF zu einer 4-AP-Lösung und warten Sie 12 Minuten, bis die 4-AP-induzierte rhythmische Aktivität den Steady State erreicht hat (2 Minuten, bis die Medikamente das Bad erreichen, und 10 Minuten, bis die Aktivität ihren Höhepunkt erreicht und dann ein Plateau erreicht hat).
- Rekord von 5 Minuten 4-AP-induzierter Aktivität. Bereiten Sie sich auf nachfolgende Aufnahmen vor, um die Medikamente zu testen oder die Stabilität von 4-AP zu überprüfen.
Tabelle 1: Zusammensetzungen der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit.
kg
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kg
kg
kg
| chemisch | aLiquor (mM) | Liquor (g/100 mL) | Saccharose-substituiertes aCSF (mM) | Saccharose-substituiertes aCSF (g/100 mL) | Kaliumreicher aCSF (mM) | Kaliumreicher aCSF (g/100 ml) |
| Natriumchlorid (NaCl) | Nr. 118 | 0,690 | - | - | Nr. 118 | 0,690 |
| Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 | 25 | 0,210 |
| Traubenzucker | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 | 10 | 0,180 |
| Kaliumchlorid (KCl) | 2,5 | 0,019 | 2,5 | 0,019 | 4,5 | 0,034 |
| Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO4) | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 | 1 | 0,012 |
| Magnesiumclorid (MgCl2) | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 | 1 | 0,01 |
| Calciumchlorid (CaCl2) | 2,5 | 0,028 | 2,5 | 0,028 | 2,5 | 0,028 |
| Saccharose | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
Tabelle 2: Mikroelektrodenarray-Layouts.
cm
cm
cm
cm
| Mikroelektroden-Array-Layouts |
| Mikroelektroden-Array-Modell | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-Ti | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| Planar oder 3-dimensional (3D) | flach | 3d | 3d | flach |
| Elektroden-Gitter | 8 x 8 | 8 x 8 | 8 x 8 | 6 x 10 |
| Elektrodenabstand | 200 μm | 100 μm | 200 μm | 500 μm |
| Durchmesser der Elektrode | 30 μm | 12 μm | 12 μm | 30 μm |
| Elektrodenhöhe (3D) | N/A | 40 μm | 50 μm | N/A |
| Experimente | Querscheibe | Querscheibe | Sagittal + Horizontal | Sagittal + Horizontal |
