Aufzeichnung von Veränderungen der Aktivität des sympathischen Nervus der Niere in der Niere als Reaktion auf den arteriellen Druck bei Ratten

Zusammenfassung

Quelle: Fink, A. M., et al. Quantifizierung akuter Veränderungen der Aktivität des sympathischen Nierennervs als Reaktion auf Manipulationen des Zentralnervensystems bei anästhesierten Ratten. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Untersuchung der Aktivität von renalen sympathischen Nerven (RSNs) als Reaktion auf Veränderungen des arteriellen Drucks bei Ratten. Beim Anlegen eines Druckkatheters an die Oberschenkelarterie werden die sympathischen Nerven der Niere freigelegt. Die Nerven werden dann auf eine Aufzeichnungselektrode gehoben und ihre elektrische Aktivität aufgezeichnet. Als nächstes wird ein gefäßverengendes Medikament injiziert, um den Blutdruck zu erhöhen, und entsprechende Veränderungen der RSN-Aktivität werden überwacht.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Bipolare RSNA-Elektroden erstellen

1. Um die Elektrode herzustellen, schneiden Sie zwei Stücke Edelstahldraht mit einer Länge von jeweils ca. 18 mm ab. Schneiden Sie ein Stück Schlauch aus Polyethylen (PE-50) mit einer Länge von ca. 15 mm ab. Führen Sie beide Drahtstücke in den Schlauch ein, so dass der Draht an beiden Enden herausragt.
2. Entfernen Sie die Isolierung von den Enden der Drähte; schneiden Sie die Drähte ab und lassen Sie 2-3 mm freiliegenden Draht übrig. Crimpen Sie an einem Ende die Steckerstifte über den freiliegenden Draht. Löten Sie die Stifte fest mit dem Draht verlöten, befestigen Sie die Stifte in einer Verbindungsleiste und decken Sie die Verbindung mit Epoxidharz ab.
   Anmerkung: Ein alternativer Ansatz, um das Löten zu vermeiden, ist die Verwendung von Krokodilklemmen mit Schnellverbindung/-löse.
3. Entfernen Sie am gegenüberliegenden Ende der Elektrode die Isolierung von den Enden der Drähte, so dass 2-3 mm freiliegender Draht übrig bleiben. Biegen Sie diesen Teil der Drähte, um kleine "V"-förmige Haken im unisolierten Draht zu erzeugen.
   Anmerkung: Dies ist der Teil der Elektrode, der mit dem sympathischen Nerv der Niere in Kontakt kommt. Es ist wichtig, dieses Ende abzudichten, um zu verhindern, dass Flüssigkeiten in den Schlauch gelangen. Silikon oder Epoxidharz können effektiv verwendet werden.

>2. Anästhesie verabreichen und Operationsstellen vorbereiten

1. Verabreichen Sie eine männliche Sprague-Dawley-Ratte (Alter 9-11 Wochen, mit einem Gewicht von 150-400 g). Verabreichen Sie Pentobarbital-Natrium 50 mg/kg über eine intraperitoneale (IP) Injektion. Um eine stabile Anästhesieebene während der Operation zu beurteilen, überprüfen Sie den Zehenkneifreflex alle 15 Minuten und dosieren Sie die Anästhesie bei Bedarf erneut.
   Anmerkung: Pentobarbital-Natrium (Nembutal) wurde in früheren Studien verwendet, um eine anhaltende Anästhesieebene zu erreichen, ohne die Modulation von RSNA zu beeinträchtigen. Dieses Protokoll gilt für Operationen ohne Überleben, so dass es keine Erholungs-/postoperative Überwachungsphase gibt.
2. Bereiten Sie die Operationsstelle gemäß den Richtlinien der institutionellen Tierhaltung vor (d. h. rasieren Sie den Bauch, den Rücken und den Kopf der Ratte, reinigen Sie die Haut mit 10% Povidon-Jod-Lösung, tragen Sie Augenschmiermittel auf und legen Sie die Ratte auf ein Heizkissen). Halten Sie die Körpertemperatur während der Versuche bei 37 °C.

>3. Kanülierung der Oberschenkelarterie zur Überwachung des mittleren arteriellen Drucks

1. Visualisieren Sie die Arterie unter dem Mikroskop. Ähnlich wie bei der venösen Kanülierung binden Sie die distale Naht, um die Arterie zu verschließen. Befestigen Sie die Ränder dieser Naht mit Seidenband am Operationsfeld und positionieren Sie die Arterie senkrecht zur dominanten Hand des Chirurgen.
2. Arterieller Zugang bei Verwendung von Telemetrie
   1. Untersuchen Sie den Druckmesskatheter unter starker Vergrößerung, bevor Sie eine arterielle Kanüle durchführen. Stellen Sie sicher, dass der Katheter frei von Blasen / Ablagerungen ist und einen intakten Meniskus zwischen den flüssigkeitsgefüllten (proximalen) und gelgefüllten (distalen) Komponenten hat. Vor jeder Implantation füllen Sie das Gel an der distalen Spitze des Katheters nach. Schalten Sie den Sender mit einem Magneten ein. Überwachen Sie den Blutdruck (BP) während der Operation, um eine perfekte Platzierung zu gewährleisten.
   2. Verwenden Sie einen lockeren Überhand-Halbknoten in der proximalen Naht, um die Oberschenkelarterie kurz zu verschließen. Halten Sie den Kathetereinführer in der nicht dominanten Hand. Halten Sie die Spitze der Kanüle der Telemetrieeinheit mit einer Gefäßkanülenzange fest, um ein Verdrängen des Gels von der Spitze zu vermeiden.
   3. Mit der gebogenen 22G-Nadel ein Loch in die Arterie stechen und die Kanüle mit einer Gefäßkanülenzange in die Arterie einführen, um ein Verdrängen des Gels von der Spitze zu vermeiden. Schieben Sie die Kanüle so weit wie möglich vor. Befestigen Sie den Druckkatheter mit den proximalen und distalen Nahtbindern.
   4. Stecken Sie den Körper des Telemetrieimplantats in die Flanke neben dem Schnitt und schließen Sie diesen Schnitt mit einer 4-0-Nylonnaht auf einer Schneidenadel. Schalten Sie die Telemetriegeräte am Ende des Aufnahmezeitraums per Magnet aus, um die Akkulaufzeit zu verlängern.

>4. Positionieren Sie die Ratte im Rahmen der stereotaktischen Chirurgie, um Zugang zum Gehirn zu erhalten

1. Bewegen Sie die Ratte vorsichtig in die Bauchlage im Rahmen der stereotaktischen Chirurgie.
2. Positionieren Sie die Ratte zwischen den Ohrbügeln und stellen Sie den Schneidezahn so ein, dass die Höhe von Lambda und Bregma ausgeglichen wird. Die Positionierung kann vom Rattenstamm, dem Gewicht und der Lage der Ziele des Zentralnervensystems (ZNS) abhängen.
3. Machen Sie einen 2 cm langen rostrocaudalen Skalpellschnitt durch die Mittellinie der Kopfhaut. Entfernen Sie mit Applikatoren mit Wattespitze das Bindegewebe fest von der Schädeloberfläche. Tragen Sie Wasserstoffperoxid auf den Schädel auf, um die Visualisierung der Bregma-, Lambda- und Mittelliniennähte zu unterstützen.
4. Bohren Sie mit einem Atlas des Rattengehirns eine Bohrlochosteotomie, die für den Elektrodenzugang ausgelegt ist, durch den Schädel.

>5. Isolierung der sympathischen Nerven der Niere

1. Verbinden Sie die Draht-RSNA-Elektrode (Schritte 1.1-1.3) mit einem 10X-Vorverstärker und Mikroelektrodenverstärker.
2. Isolieren Sie die Nierennerven durch einen retroperitonealen Schnitt, bevor oder nachdem die Ratte im stereotaktischen Rahmen gesichert ist. Positionieren Sie die RSNA-Elektroden, sobald sich die Ratte im stereotaktischen Rahmen befindet. Machen Sie einen Skalpellschnitt, der sich von 4-5 cm unterhalb der Rippen in kaudaler Richtung leicht lateral der Wirbelsäule erstreckt. Blunt seziert den Schnitt, um die paraspinalen Muskeln sichtbar zu machen.
3. Machen Sie mit einer Schere einen sehr oberflächlichen 1-2 cm langen rostrocaudalen Schnitt, wo das Fett auf den Muskel trifft. Verteilen Sie das Fett mit Watteapplikatoren vom Muskel weg, um die Niere sichtbar zu machen. Es ist wichtig, nicht in den Peritonealraum einzudringen.
4. Verwenden Sie Retraktoren, um die Niere sanft von den paraspinalen Muskeln zu trennen, um die Nierenarterie und die Bauchschlagader sichtbar zu machen. Dehnen Sie die Gefäße nicht übermäßig, um eine Schädigung der Nierennerven zu vermeiden. Verwenden Sie ein 2" x 2" Wattegazepad, das in Kochsalzlösung getränkt ist, um die Niere vor Verletzungen zu schützen.
5. Identifizieren Sie bei starker Vergrößerung die Nierennerven in der Inzisionstasche. Die Nervenbündel sind am besten im rechten Winkel sichtbar, der von der Aorta und der Nierenarterie gebildet wird. Die Nierennerven folgen der Nierenarterie von der Aorta bis zu den Nieren
.
6. Wählen Sie ein Segment des Nervenbündels aus, das auf der Aufzeichnungselektrode platziert werden soll. Präparieren Sie die Nervenfasern vorsichtig mit einer Mikro-Präparierpinzette aus dem umgebenden Gewebe/Gefäß.
7. Befestigen Sie die RSNA-Drahtelektrode in einer Halterung (z. B. einer Krokodilklemme, die an einem Stützständer befestigt ist). Senken Sie die Elektrode auf Höhe des Nervensegments ab. Mit einem Nervenhaken heben Sie das Segment des Nierennervs sanft auf die Elektrode, ohne den Nerv zu dehnen.
   Anmerkung: Der Nerv sollte in beiden "V"-förmigen Haken im unisolierten Draht parallel zum Nerv ruhen. Die Elektrodendrähte dürfen kein anderes Gewebe, Blut oder Lymphflüssigkeit berühren.
8. Füllen Sie den Einschnitt mit Mineralöl, um zu verhindern, dass der freiliegende Sympathikus der Niere trocken wird. Verwenden Sie einen Erdungsclip, dessen ein Ende auf der Haut des Schnitts liegt und das andere am Faradayschen Käfig befestigt ist.
9. Leiten Sie das Signal über Hoch- und Tiefpassfilterung (10 Hz und 3 kHz) an die Verstärker. Stellen Sie die Verstärkung auf bis zu 10 K ein. Fügen Sie einen Audiomonitor hinzu, um das Berstmuster des RSNA zu beurteilen. Verwenden Sie Abtastraten zwischen 2.000 und 10.000 Hz. Verwenden Sie eine erhöhte Abtastrate, wenn die Hypothese besteht, dass eine ZNS-Manipulation schnelle/kurze sympathische Reaktionen hervorruft.

>6. Daten aufzeichnen

1. Beurteilen Sie die Qualität der RSNA-Aufzeichnung, indem Sie den Baroreflex mit einer Bolusinjektion von 1 ml Kochsalzlösung oder 10 μg/ml Phenylephrin (in 0,1 ml) intravenös hervorrufen. Wie in Abbildung 1 dargestellt, sollte die Infusion den Blutdruck erhöhen und RSNA hemmen. Eine Erhöhung des mittleren arteriellen Drucks um 60-80 mmHg ist für eine renale Sympathoinhibition ausreichend.
2. Passen Sie die Position der Elektroden an, um das Signal bei Bedarf zu verbessern. Eine Reposition ist erforderlich, wenn der Nerv nicht mit beiden Haken an der Elektrode in Kontakt kommt oder wenn Gewebe, Blut oder Lymphflüssigkeit mit den Drähten in Kontakt kommen.
   Anmerkung: Die Notwendigkeit einer Neupositionierung beruht auf den auditiven Eigenschaften der Nervenentladungen.
3. Sobald ein klares Signal erhalten wird, sichern Sie die RSNA-Elektrode an Ort und Stelle, indem Sie Mineralöl herausziehen und ein Kieselgel auftragen, um die Nerven-Elektroden-Verbindung in der Inzisionstasche abzudecken. Bewegen Sie die Ratte nicht, bevor das Gel vollständig ausgehärtet ist.
4. Führen Sie ZNS-Manipulationsprotokolle durch, während Sie kontinuierlich RSNA und den mittleren arteriellen Druck aufzeichnen. Wenn ein Mikroinjektor/Pulser für Hirnstammmanipulationen verwendet wird, kann ein Logiksignal von diesem Gerät in die RSNA/BP-Aufzeichnungen eingeführt werden, um den Zeitpunkt der ZNS-Manipulationen zu dokumentieren.
5. Wenn das Experiment abgeschlossen ist, bestimmen Sie den Geräuschpegel, indem Sie den Nerv proximal zu den Aufzeichnungselektroden zwischen dem Kieselgel und dem Wirbelsäulenmuskel quetschen. Notieren Sie mindestens 30 s dieses "Null"-Werts für RSNA. Als alternativer Ansatz zur Quantifizierung des Rauschens ist die Verabreichung eines kurz wirkenden Ganglionblockers wie Atropin, Hexamethonium, Chlorisondamin oder Pentoliniumtartrat.
6. Entfernen Sie vorsichtig die RSNA-Elektrode und entfernen Sie alle Spuren von Kieselgel von den Drahtelektroden. Bewahren Sie die Elektrode zur Wiederverwendung auf. Schalten Sie den Telemetriesender aus und entfernen Sie ihn, wobei Sie darauf achten müssen, die Spitze des Katheters nicht zu beschädigen.

Ergebnisse

Abbildung 1: RSNA und BP als Reaktion auf die Phenylephrin-Injektion i.v.Das Roh-RSNA (A) war vollwellig gleichgerichtet (B); Rektifiziertes zerkleinertes RSNA "Null" ist in Einschub C dargestellt. Es wurden nicht überlappende 10 s-Mittelwerte (minus Rauschen) berechnet (D). Um den Baroreflex hervorzurufen, wurden 0,1 ml Phenyleph...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Draht aus rostfreiem Stahl	A-M-Systeme; Sequim, WA	Artikel-Nr.: 791000	RSNA-Elektrode
Schlauch aus Polyethylen (PE-50)	VWR; Radnor, PA	Tel.: 63019-048	RSNA-Elektrode; Kanülierung für Gefäße
Miniatur-Pin-Steckverbinder	A-M-Systeme; Sequim, WA	Artikel-Nr.: 520200	RSNA-Elektrode
Crimp-Werkzeug	Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. M22520	RSNA-Elektrode
Steckerleiste	Amphenol; Clinton Township, Michigan	Tel.: 221-2653	RSNA-Elektrode
J-B Kwik Epoxidharz	J-B Weld, Schwefelfedern, TX	8270	RSNA-Elektrode
Silikon	Permatex; Hartford, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. 2222	RSNA-Elektrode
Heparin-Natrium; Injizierbar (10 mL Fläschchen, 1000 U/mL)	KV Veterinärversorgung; David City, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. P03466	Durchgängigkeit der venösen Linie
Phenylephrin HCl; Injizierbar (1 mL Fläschchen; 10 mg/ml)	ACE Chirurgische Versorgung; Brockton, Massachusetts (Vereinigte Staaten von Amerika	Tel.: 950-6312	Testen der renalen Sympathohemmung
Elastische chirurgische Stege mit einem Haken	Harvard-Apparat; Holliston, MA	Tel.: 72-2595	Einschnitt
Chirurgisches Klebeband aus Seide	3M, Minneapolis, MN	Nr. 1538-0	Sichere chirurgische Stützen
Nadeln, 20 g	Sigma-Aldrich; St. Louis, Vereinigte Staaten von Amerika	Z192554-100EA	Kanülierung von Gefäßen
Dumont #7 gebogene Pinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge; Foster City, Kalifornien	Nr. 11274-20	Kanülierung von Gefäßen
5-0 Nahtkrawatten aus Seide	Braintree Wissenschaftlich; Braintree, MA	SUT-S 106	Kanülierung von Gefäßen
Zarte hämostatische Pinzette	Roboz Chirurgisches Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-7117	Gefäßkanülierung und RSNA-Chirurgie
Crile Hämostatische Pinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge; Foster City, Kalifornien	Nr. 13004-14	Biegen der Nadel
Telemetrie-Sender	Datenwissenschaften International; Minneapolis, Minnesota (Vereinigte Staaten von Amerika)	PA-10	Überwachung des mittleren arteriellen Drucks (Telemetrie)
Re-Gel-Spritze	Datenwissenschaften International; Minneapolis, Minnesota (Vereinigte Staaten von Amerika)	Artikel-Nr.: 276-0038-001	Wiederverwendung von Sendern (Telemetrie)
Einweg-Druckmessumformer	Transpac; San Clemente, Kalifornien	MI-1224	Überwachung des mittleren arteriellen Drucks
Clear-Cuff Druck-Infuser	MILA International Inc.; Florenz, Kentucky	2281339	Überwachung des mittleren arteriellen Drucks
Kanülenzange für Gefäße	Feine wissenschaftliche Werkzeuge; Foster City, Kalifornien	Tel.: 00574-11	Einführen eines Katheters
Schwarzes monofiles Nylon 4-0 Naht auf umgekehrter Schnittnadel	McKesson Medizinisch-Chirurgisch; San Francisco, Kalifornien	Nr. S661GX	Sicherer Telemetriesender
Telemetrie-Empfänger	Datenwissenschaften International; Minneapolis, Minnesota (Vereinigte Staaten von Amerika)	RPC-1	Überwachung des mittleren arteriellen Drucks (Telemetrie)
LabChart Pro (Software), PowerLab (Erfassungshardware)	AD-Instrumente; Colorado Springs, Colorado (Vereinigte Staaten von Amerika)	ML846, MX2-Matrix 2.0 (kompatibel mit Data Science International-Telemetrie)	3 Optionen für Software/Erfassungshardware
SciWorks (Software), DataWave (Erfassungshardware)	DataWave Technologies, Loveland, CO	N/A
Spike 2 (Software), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., London, Großbritannien	Nr. 1401-3
Mikro-Bohrer	Roboz Chirurgisches Instrument Co.; Gaithersburg, MD	RS-6300	ZNS-Chirurgie
Rahmen für stereotaktische Chirurgie	Stoelting; Wood Dale, Illinois	Artikel-Nr.: 51600	ZNS-Chirurgie
Mikroelektrodenverstärker mit 10X Vorverstärker	A-M-Systeme; Sequim, WA	Nr. 1800-2	RSNA-Aufzeichnung
Retraktoren	Feine wissenschaftliche Werkzeuge; Foster City, Kalifornien	Nr. 17009-07	RSNA-Aufzeichnung
Mikro-Präparierpinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge; Foster City, Kalifornien	Nr. 11251-10	RSNA-Aufzeichnung
Mikro-Haken	Feine wissenschaftliche Werkzeuge; Foster City, Kalifornien	Nr. 10064-14	RSNA-Aufzeichnung
Mineralöl	Fischer Wissenschaftlich; Waltham, MA	Artikel-Nr.: 8042-47-5	RSNA-Aufzeichnung
Audio-Monitor	A-M-Systeme; Sequim, WA	3300	RSNA-Aufzeichnung
Kieselgel	Wacker, München; Deutschland	RT601A-B	RSNA-Aufzeichnung
Elektrische Clips	Tyco Elektronik; Schaffhausen, Schweiz	EB0283-000	Erdung oder Sicherung der Perfusionsnadel
Bonn Schere, gerade/scharfe Spitze	Roboz Chirurgisches Instrument Co; Gaithersburg, MD	RS-5840	Perfusion
Sondennadel	Harvard-Apparat; Holliston, MA	Tel.: 75-0286	Perfusion
Masterflex Perfusionspumpe	Cole-Parmer; Vernon Hills, Illinois	Artikel-Nr.: 7524-10	Perfusion
Platinvernetzte Silikonschläuche von Masterflex	Cole-Parmer; Vernon Hills, Illinois	Artikel-Nr.: 96410-15	Perfusion
Formalin (10%ige gepufferte Lösung; 4 L)	Sigma-Aldrich; St. Louis, Vereinigte Staaten von Amerika	HT501128	Perfusion
Saccharose	Sigma-Aldrich; St. Louis, Vereinigte Staaten von Amerika	Nr. S0389	Kryoschutz