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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen
- Übertragen Sie den ersten Gewebeschnitt in die Aufnahmekammer, die in einen kontinuierlichen Fluss von Krebslösung getaucht ist. Montieren Sie den Abschnitt mit leichten Gewichten und tauchen Sie das Objektiv ein.
- Identifizieren Sie die striatale Region im Mikroskop und suchen Sie nach GFP-positiven (reprogrammierten) Neuronen. Wählen Sie ein Neuron aus, das in der Morphologie großflächig ist und nicht von Faserbündeln oder Blutgefäßen bedeckt ist.
- Bereiten Sie Borosilikatglaspipetten (3–7 MΩ) für das Patchen vor und füllen Sie sie mit der folgenden intrazellulären Lösung (in mM): 122,5 Kaliumgluconat, 12,5 KCl, 0,2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0,3 Na3GTP und 8 NaCl, eingestellt auf pH 7,3 mit KOH.
- Befestigen Sie die Glaspipette an der Aufzeichnungselektrode und tauchen Sie sie in die Lösung. Überprüfen Sie den Widerstand der Elektrode. Nähern Sie sich dann langsam mit der Pipette der Zelle und üben Sie dabei einen leichten positiven Druck auf die Elektrode aus, um ein Verstopfen der Spitze zu vermeiden.
Vorsicht: Achten Sie darauf, dass Sie Ihre Zelle im Auge behalten, während Sie die Elektrode absenken, und dass Sie die Fluoreszenz in der Zelle nicht bleichen (d. h. schalten Sie die Fluoreszenzlampe aus, wenn Sie sie nicht benötigen).
- Spülen Sie das umgebende Gewebe vorsichtig mit Überdruck der Elektrode und nähern Sie sich der Zelle mit der Elektrode. Platzieren Sie die Elektrode direkt auf der Zelle und senken Sie sie ab, bis die Elektrode die Membran berührt. Machen Sie eine Giga-Ω-Dichtung zwischen der Elektrode und der Zellmembran und brechen Sie die Membran mit Unterdruckimpulsen auf, um ein Ganzzellpflaster zu erzeugen.
Vorsicht: Reprogrammierte Neuronen sind empfindlich. Seien Sie vorsichtig beim Patchen und üben Sie nicht zu viel Unterdruck aus, wenn Sie eine Giga-Ω-Versiegelung erreichen oder die Zellmembran öffnen. Außerdem erfordert das Aufkleben älterer Tiere Übung und Geduld, da ihr Bindegewebe dicker ist und es schwieriger ist, die Neuronen sichtbar zu machen.
- Prüfen Sie sofort nach dem Einfahren im Stromzangenbetrieb die Ruhepotentiale der Membran und notieren Sie diese für die Analyse.
- Halten Sie die Zelle in der Stromzange zwischen -60 mV und -80 mV und injizieren Sie 500 ms Ströme von -20 pA bis +90 pA, mit 10 pA-Schritten, um Aktionspotentiale zu induzieren.