Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereiten des Tieres für die Bildgebung
- Legen Sie sterile Gaze, Wattestäbchen und autoklavierte chirurgische Instrumente in den Operationsbereich. Schalten Sie einen Micro Bead Sterilizer für die interchirurgische Sterilisation von chirurgischen Instrumenten ein.
- Anästhesieren Sie die Maus (männlich oder weiblich, 1,5–2,5 Monate, 20–25 g) durch intraperitoneale Injektion (i.p.) einer Mischung aus Ketamin (17,2 mg/ml), Xylazin (0,475 mg/ml) und Acepromazin (0,238 mg/ml) (6 μl/g Körpergewicht). Warten Sie, bis die richtige Narkosetiefe erreicht ist, wenn das Tier nicht mehr auf einen Zehenkneifreiz reagiert und keinen Hornhautreflex mehr hat. Geben Sie während der Operation eine Auffrischungsdosis von 1/3 der ursprünglichen Dosis des Anästhesiecocktails, um den ursprünglichen Anästhesiezustand aufrechtzuerhalten.
- Injizieren Sie Buprenorphin subkutan (s.c.; 0,05–0,10 mg/kg) als Analgetikum vor der Operation. Tragen Sie eine Schutzsalbe auf die Augen des Tieres auf, um das Austrocknen der Hornhaut und die Bildung des Grauen Stars zu verhindern.
- Legen Sie eine transgene GCaMP6s-Maus auf ein Heizkissen, um eine Unterkühlung zu verhindern, und decken Sie es mit einem sterilen OP-Tuch ab. Stabilisieren Sie den Kopf des Tieres mit einem Kopfhalteadapter für Mäuse.
- Rasieren Sie den Kopf über den größten Teil der Kopfhaut mit einer zweischneidigen Rasierklinge. Reinigen Sie den Operationsbereich mit einem sterilen Alkohol-Vorbereitungspad, gefolgt von einer Povidon-Jod-Lösung.
>2. Chronische Vorbereitung von Schädelfenstern
- Machen Sie einen rechteckigen Schnitt der Kopfhaut (2 mm x 3 mm) mit einer Schere auf einer Seite (rechts) des Schädels. Schieben Sie die Haut mit einem Wattestäbchen zur Seite, um einen Belichtungsbereich von >3 mm Durchmesser zu erhalten (Abbildung 1A). Entfernen Sie das am Schädel haftende Bindegewebe, indem Sie den Schädel vorsichtig mit einer stumpfen mikrochirurgischen Klinge (Skalpellklinge #10; Abbildung 1C).
- Markieren Sie den S1-Bereich, indem Sie mit einem Zahnbohrer vorsichtig einen Kreis (3 mm Durchmesser, Zentrumskoordination: -1,5 mm von der Bregma und 2,5 mm von der Mittellinie) auf den Schädel zeichnen (Abbildung 2B).
- Führen Sie das gleiche Verfahren am linken Schädel durch (Abbildung 2B).
- Tragen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylat-Sekundenkleber auf den Knochen auf, um eine Basis für das Auftragen von Zahnzement zu schaffen.
- Verdünnen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einem Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer eine kreisförmige Rille im Schädel um den S1-Bereich herum (Abbildung 1D). Der Zweck besteht darin, eine glatte Kante für die Platzierung eines optischen Fensters darauf zu schaffen.
- Tragen Sie während des Ausdünnungsprozesses wiederholt künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF, Raumtemperatur) auf den Schädel auf, um das Bohren zu erleichtern und die Wärme abzuleiten. Führen Sie die Bohrung mit Unterbrechungen durch, um eine reibungsbedingte Überhitzung zu vermeiden. Saugen Sie die Knochenreste mit einer Hausvakuumleitung oder einer Vakuumpumpe ab.
- Nachdem ca. 2/3 der Tiefe des Knochens gebohrt wurde, dünnen Sie den restlichen 1/3 Knochen langsam und vorsichtig aus, bis ein kreisförmiges Stück des Schädels (Knochenlappen) vollständig vom umgebenden Schädel befreit ist.
- Entfernen Sie langsam und vorsichtig den kreisförmigen Knochenlappen mit einer Pinzette # 5/45 und legen Sie die Dura frei (Abbildung 2C; Abbildung 1E).
- Halten Sie die exponierte Hirnregion mit ACSF feucht (Abbildung 1E). Vermeiden Sie Schäden an den Pialgefäßen, da Blutungen den zerebralen Blutfluss verändern, die Schwellung des Gehirns beschleunigen und die Bildqualität stark beeinträchtigen.
- Führen Sie die gleiche Prozedur auf der linken (kontralateralen) Seite des Schädels durch.
- Verwenden Sie für die Montage des optischen Fensters optischen Klebstoff, um die Deckglasschichten nacheinander zu kleben und auszuhärten. Bei Bedarf das optische Fenster (50 °C für 12 h) in einem Inkubator erwärmen, um die Klebeverbindung zu verbessern. Das optische Fenster besteht aus 2 Teilen: Der obere Teil enthält ein einzelnes rundes Deckglas mit einem Durchmesser von 5 mm und der untere Teil enthält 1-3 runde Deckgläser mit einem Durchmesser von 3 mm (Abbildung 2D).
- Lagern Sie das optische Fenster in Ethanol (70 %, vol/vol) und spülen Sie es vor Gebrauch mit steriler Kochsalzlösung aus. Überprüfen Sie vor der Installation des optischen Fensters das optische Fenster auf Unvollkommenheiten, einschließlich einer falschen Menge an optischem Klebstoff oder einer ungenauen Ausrichtung unter einem Stereoskop.
- Bringen Sie das optische Fenster über dem Kraniotomiebereich an (Abbildung 2D). Der obere Teil des optischen Fensters ruht auf dem Schädel, und der untere Teil des optischen Fensters passt in die kraniotomisierte Öffnung und ruht in Gegenwart von Liquor auf der Dura (Abbildung 2D, E).
- Versiegeln Sie den oberen Teil der optischen Fensterkante mit dem Cyanacrylat-Sekundenkleber zum Schädel (Abbildung 2F; Abbildung 1F).
- Wenn der Cyanacrylat-Sekundenkleber getrocknet ist, tragen Sie schwarzen Zahnzement (Dentsply) auf, um die Glaskante zu bedecken. Tragen Sie Zahnzement auf alle freiliegenden Schädel- und Wundränder auf, um das Licht zu blockieren (Abbildung 2G-H; Abbildung 1B).
- Führen Sie den gleichen Vorgang auf der linken Seite durch.
- Lassen Sie das Tier sich auf dem Heizkissen erholen und bringen Sie das Tier zur Genesung unter angemessener Überwachung in seinen Heimatkäfig zurück. Stellen Sie Nassfutter bereit, um das Kauen und die Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern. Um die Schmerzen zu lindern, verabreichen Sie Buprenorphin s.c. (0,05–2,0 mg/kg) alle 8–12 Stunden nach der Verletzung für 2 Tage. Lassen Sie die Maus weitere 7 bis 10 Tage erholen, bevor Sie die Bildgebung durchführen.
