Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Schläuchen, Elektroden und Instrumenten für den chirurgischen Eingriff
- Verwenden Sie die folgenden mikrochirurgischen Instrumente: chirurgische Schere, abgewinkelte Mikroschere, Gewebezange, ein Paar gebogene Mikropinzetten Dumont #7 und #5, einen Mikronadelhalter und Retraktoren.
Anmerkung: Da es sich um einen akuten Eingriff handelt, müssen die Instrumente nicht sterilisiert werden. Nach Gebrauch die Spitzen reinigen und mit 70% Ethanol abwischen.
- Weichen Sie den Schlauch in 70 % Ethanol ein und spülen Sie ihn dann vor Gebrauch mit sterilem 0,9 % NaCl mit 100 U/ml Heparin aus. Lassen Sie den Schlauch gefüllt, um zu vermeiden, dass Luftblasen in das System gelangen.
- Schneiden Sie ein 20-30 cm langes Stück Polyethylen (PE)-50-Schlauch ab, um einen Katheter für die intrakavernöse Druckmessung (ICP) herzustellen. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch so kurz wie möglich ist, um die Dämpfung des Drucks zu reduzieren.
- Biege eine sterile 24G-Nadel von einer Seite zur anderen, bis die Nadel in der Mitte bricht. Verbinden Sie das Stück mit der Fase mit dem distalen Ende des PE-Schlauchs, um es in die Peniscrus einzuführen. Stecken Sie die andere Hälfte in die Nabe, um sie an den Druckmessumformer anzuschließen. Füllen Sie das System mit heparinisierter Kochsalzlösung (100 U/ml).
- Um die bipolare Teflon-beschichtete Elektrode herzustellen, schneiden Sie zwei 125 μm große Silberdrähte auf die gleiche Länge. Befestigen Sie die Drähte mit einem Stück Klebeband an der Tischkante und fädeln Sie sie zusammen. Befestigen Sie dann die Elektrode an einer schwarzen Platte.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt in das Teflon und verwenden Sie eine Mikrozange #5, um eine 4-5 mm lange Teflonbeschichtung von den Spitzen der Elektroden zu entfernen. Schneide die Spitzen mit einem Skalpell ab, um eine gleichmäßige Länge zu erreichen, und mache Haken, indem du die Enden um die stumpfe Kante einer Skalpellklinge biegst.
- Kleben Sie die Elektrode so fest, dass das Ende leicht über den Rand der schwarzen Platte hinausragt, wobei die Haken nach oben zeigen. Den Silikonkleber auf einer Kunststoffplatte 10 s einwirken lassen und eine Klebeblase 1-2 mm vom Haken entfernt um die Elektrode wickeln.
- Lassen Sie es vor Gebrauch ca. 5 Minuten trocknen (Abbildung 1). Entfernen Sie das Teflon von einem längeren Abschnitt am anderen Ende, um eine Verbindung zum Stimulator zu ermöglichen.
Anmerkung: Wenn die Haken am distalen Ende neu gemacht werden, kann die Elektrode viele Male wiederverwendet werden.
>2. Vorbereitung des Tieres
- Nachdem Sie das Tier betäubt haben, rasieren Sie die untere Hälfte des Bauches, des Halses und des Perineums. Schrubben Sie das Tier mit 70% Alkohol, gefolgt von Povidon-Jod dreimal. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf eine beheizte Operationsunterlage. Tragen Sie Tieraugensalbe auf und stellen Sie die Anästhesie auf einen Nasenkonus mit 2,5 % Isofluran und 0,8 l/min Sauerstoff als Träger um.
Anmerkung: Passen Sie den Isofluran- und Sauerstoffgehalt an, um ein akzeptables Anästhesieniveau zu erreichen.
>3. Präoperative Vorbereitung
- Führen Sie den gesamten chirurgischen Eingriff unter dem Operationsmikroskop durch: Eine Vergrößerung von 3,15x bis 20x ist ausreichend. Tragen Sie Handschuhe und sorgen Sie während der gesamten Operation für eine saubere Umgebung. Lege die Ratte auf ein Tuch.
>4. Ischiocavernosus-Muskeldissektion für die ICP-Messung
- Verwenden Sie ein Skalpell, eine gerade Schere und eine gebogene Dumont #7 Mikrozange, um einen 1 cm langen vertikalen Hautschnitt 5 mm lateral zur Mittellinie zu machen, der auf Höhe der Peniswurzel beginnt und sich nach unten erstreckt (Abbildung 2A). Verwenden Sie ein Wattestäbchen und trennen Sie vorsichtig die Faszien lateral des Hodensacks (Abbildung 2B). Nachdem Sie die Faszie präpariert haben, befestigen Sie Retraktoren und tasten Sie mit einer Wattespitze ab, um den Sitzbeinhöcker zu finden (Abbildung 2C).
- Präparieren Sie durch das Fettgewebe medial dieses Punktes, bis der Musculus ischiocavernosus sichtbar ist (Abbildung 3A). Verwenden Sie eine Dumont #7 gebogene Mikrozange und trennen Sie den Muskel in Längsrichtung. Die Tunica albuginea erscheint als hellweiße Struktur (Abbildung 3B). Mit einer Mikrozange und einer Mikroschere die Tunica albuginea ausreichend freilegen, um ihren Verlauf zu sehen (Abbildung 3C).
- Nach der Kalibrierung der Systemeinstellungen führen Sie einen Schlauch durch die Haut am Perineum und stellen Sie sicher, dass er parallel zu den Peniscrus verläuft (Abbildung 4). Lassen Sie die Linie an Ort und Stelle und halten Sie den Schnitt mit Kochsalzlösung feucht.
>5. KN-Dissektion zur Stimulation
- Machen Sie einen 2 cm tieferen, mittleren Bauchschnitt durch die Haut, zuerst mit einem Skalpell und dann mit einer geraden Schere und einer Mikrozange. Ziehen Sie einen passenden Schnitt durch die Faszie entlang der Linea alba und des darunter liegenden Muskelgewebes, um die Blase und die Prostata freizulegen.
- Verwenden Sie Retraktoren, um eine gute Belichtung zu erzielen. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Prostata vom Fettgewebe zu trennen, um eine klare Visualisierung des großen Beckenganglions (MPG) und des Nervus cavernosus (CN) zu erhalten, die auf der dorsolateralen Seite der Prostata verlaufen (Abbildung 5).
- Nach der Visualisierung des MPG und des CN wird die über dem Nerv liegende Faszie 2-5 mm distal des MPG vorsichtig mit einer abgewinkelten Mikroschere eingeschnitten (Abbildung 6a). Verteilen Sie mit einer Mikrozange #5 das Gewebe auf jeder Seite des Nervs und darunter, um einen 4 mm langen Abschnitt freizugeben (Abbildung 6b), und schieben Sie eine 9-0-Naht unter den Nerv (Abbildung 6c).
- Heben Sie den Nerv mit Hilfe der Naht leicht an (Abbildung 7a), um die Platzierung der Haken der bipolaren Elektrode um den Nerv herum zu erleichtern (Abbildung 7b). Lassen Sie einen Assistenten den Zweikomponenten-Silikonkleber 5 s lang mit der Spitze einer Insulinnadel mischen. Trocknen Sie den Nerv und tragen Sie den Kleber auf den Bereich um die Haken und den Nerv auf (Abbildung 7c, d). Halten Sie den Nerv hoch, indem Sie etwa 1 Minute lang leicht an der Elektrode ziehen, damit der Kleber trocknen kann.
- Entfernen Sie die Retraktoren, mit Ausnahme der Retraktoren auf der rechten Seite, um ein Ziehen oder Verdrehen der Elektrode zu vermeiden. Befeuchten Sie die freiliegenden Organe mit Kochsalzlösung und legen Sie in Kochsalzlösung getränkte Gaze über den Schnitt.
>6. Kavernöse Körperkanülierung für die ICP-Messung
- Wiederherstellung der Visualisierung der Tunica albuginea mit Hilfe von Retraktoren. Achten Sie darauf, die Retraktoren nicht am Musculus ischiocavernosus zu befestigen, da dies die Crus verformt.
- Befestigen Sie die Nadel und spülen Sie den Schlauch mit heparinisierter Kochsalzlösung, bevor Sie sie in die Tunica albuginea einführen. Halten Sie die Tunica albuginea gedehnt, indem Sie die gebogene Mikrozange Dumont #7 in einer Hand (nicht dominant) verwenden und die Tunica albuginea und den Rest des darüber liegenden Muskels distal zum Einstichpunkt halten. Halten Sie die Nadel mit einer geraden Mikrozange in der anderen dominanten Hand und führen Sie sie parallel zum Verlauf des Schwellkörpers ein (Abbildung 8).
- Schieben Sie die Nadel 5-8 mm in den Schwellkörper. Spülen Sie den Schlauch und drücken Sie auf die Crus, um die Leitung zu testen (Abbildung 9). Stellen Sie sicher, dass keine Lecks vorhanden sind. Befestigen Sie den Schlauch mit Klebeband am Tisch, um ein versehentliches Ziehen an der Leitung zu verhindern. Entfernen Sie die Aufrolleinroller.
>7. Stimulation des KN
- Wenn Sie das Aufzeichnungsprogramm (z. B. Spike 2) ausführen, zeichnen Sie kontinuierlich den intrakavernösen und mittleren arteriellen Druck auf.
- Stellen Sie die folgenden Parameter an einem Stimulator (z. B. SD9 Grass Instruments, siehe Materialtabelle) für die CN-Stimulation ein: Strom bei 1,5 mA, Frequenz bei 16 Hz, Spannung bei 3 V und Pulsbreite bei 5 ms. Wenden Sie 50 s Stimulation mit mindestens 1 Minute Pause zwischen den Stimulationen an.
Anmerkung: Die ersten Stimulationen führen in der Regel zu einer verminderten Reaktion (Abbildung 10).
