Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der entsprechenden tierethischen Überprüfung überprüft und genehmigt.
>1. Vorbereitung von Lösungen und Materialien
- Lösungen
- Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) (in mM) vor: 117 Natriumchlorid (NaCl), 3,6 Kaliumchlorid (KCl), 1,2 Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat (NaH2PO 4,2H2O), 2,5 Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2,2H 2O), 1,2 Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2,6H 2O), 25 Natriumbicarbonat (NaHCO3), 11 D-Glukose, 0,4 Ascorbinsäure, und 2 Natriumpyruvat. Siehe Tabelle 1.
- Bereiten Sie eine intrazelluläre Lösung auf K+-Basis (in mM) vor: 130 K-Gluconat, 5 KCl, 10 Na 2-Phosphokreatin, 0,5 Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure (EGTA), 10 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), 4 Magnesiumadenosintriphosphat (Mg-ATP) und 0,3 Lithiumguanosintriphosphat (Li-GTP). Siehe Tabelle 2.
- Intrazelluläre Lösung auf Cäsium-(Cs+)-Basis (in mM): 92 Cäsiummethansulfonat (CsMeSO4), 43 Cäsiumchlorid (CsCl), 10 Na 2-Phosphokreatin, 5 Tetraethylammonium (TEA)-Cl, 0,5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP und 0,3 Li-GTP. Siehe Tabelle 3.
Anmerkung: Alle Lösungen müssen mit destilliertem Wasser zubereitet werden. ACSF und Saccharose-ACSF sollten vor der Verwendung carbogenisiert werden (95 %O2 und 5 % CO2 -Gemisch), um einen optimalen pH-Wert von ca. 7,4 aufrechtzuerhalten, und die Osmolalität dieser beiden Lösungen sollte auf 300–310 Milliosmol (mOsm) eingestellt werden. Da Ascorbinsäure die Kalziumkanäle beeinflussen kann, muss dieses Mittel weggelassen werden, wenn man Kalziumströme aufzeichnen möchte. Die Osmolalität und der pH-Wert von intrazellulären Lösungen sollten gemessen und auf 290–300 mOsm bzw. 7,2–7,3 eingestellt werden. Es wird empfohlen, die intrazellulären Lösungen mit 0,2-μm-Filtern zu filtrieren und die Lösungen als 1-ml-Aliquots bei -20 °C zu lagern. Cs+ und TEA werden in Cs+-basierter intrazellulärer Lösung appliziert, um den Kaliumkanal zu blockieren, was für die Verwendung des Verstärkers förderlich ist, um das Membranpotential bei der Aufzeichnung von postsynaptischen Hemmströmen (IPSCs) konstant bei 0 mV zu halten.
- Instrumente
- Für ein typisches elektrophysiologisches System verwenden Sie ein aufrechtes Mikroskop, das mit Infrarot-Differenzinterferenzkontrast (IR-DIC) und einem hochauflösenden Wasserimmersionsobjektiv ausgestattet ist, eine CCD/CMOS-Kamera, einen Patch-Clamp-Verstärker, einen Mikropipettenhalter und einen Mikromanipulator, der eine Feineinstellung der Pipettenposition ermöglicht. Ein XY-Tisch wird auch benötigt, um das Mikroskop zu bewegen.
- Montieren Sie alle Geräte auf einem Schwingungsisolationstisch, der von einem Faradayschen Käfig umgeben ist. Schließen Sie einen Videomonitor an die Videokamera an, um die Neuronen zu beobachten und die Mikropipetten zu visualisieren.
- Mikropipetten
- Stellen Sie mit einem Mikropipettenabzieher Aufzeichnungselektroden aus Borosilikatglaskapillaren her. Der typische Pipettenwiderstand liegt zwischen 3 und 6 MΩ, wenn er mit intrazellulärer Lösung gefüllt wird.
>2. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen
- Um die Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen von Neuronen der Substantia gelatinosa (SG) durchzuführen, verwenden Sie für die meisten Aufzeichnungsfälle K+-basierte intrazelluläre Lösung, während Cs+-basierte Lösung nur für die Aufzeichnung von inhibitorischen postsynaptischen Strömen verwendet wird.
- Bewegen Sie eine Rückenmarksscheibe vorsichtig in die Aufnahmekammer und halten Sie sie dann mit einem U-förmigen Platindraht fest, der mit Nylonfäden befestigt ist, um eine optimale Schnittstabilität zu gewährleisten. Perfundieren Sie die Scheibe gleichmäßig mit blasenförmigem ACSF bei RT durch ein Schwerkraftsystem und stellen Sie die Perfusionsrate auf 2–4 ml/min ein, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung zu erreichen.
- Identifizieren Sie den Bereich von SG (ein durchscheinendes Band) mit einer niedrig aufgelösten Mikroskoplinse, wählen Sie ein gesundes Neuron aus, indem Sie das hochauflösende Objektiv als Zielzelle verwenden, und stellen Sie es auf die Mitte des Videomonitorbildschirms ein.
- Füllen Sie eine Mikropipette je nach Bedarf mit einem geeigneten Volumen einer intrazellulären Lösung auf K+- oder Cs+-Basis, führen Sie die Mikropipette in den Elektrodenhalter ein und stellen Sie sicher, dass die intrazelluläre Lösung den Silberdraht im Inneren des Halters berührt.
- Bringen Sie die Mikropipette in den Fokus, tauchen Sie sie mit einem Mikromanipulator in den ACSF ein und üben Sie dann einen milden Überdruck (~1 psi bei Messung mit einem Manometer) aus, um die Mikropipette von Schmutz und Ablagerungen wegzudrücken.
- Bewegen Sie die Mikropipette allmählich in Richtung des Zielneurons. Lassen Sie den Überdruck ab, sobald sich die Pipette dem Neuron nähert, und es bildet sich ein sehr kleines Grübchen auf der neuronalen Membran, um einen Gigaseal zu bilden.
- Ändern Sie das Haltepotential auf -70 mV, was nahe am physiologischen Ruhemembranpotential (RMP) einer Zelle liegt. Wenden Sie dann einen vorübergehenden und sanften Sog an der Mikropipette an, um die Membran aufzubrechen und eine gute Ganzzellkonfiguration zu schaffen.
Anmerkung: Stellen Sie nach dem Übertragen der Scheibe in die Aufnahmekammer eine gleichmäßige Perfusion für mindestens 5 Minuten sicher, um die Rückstände auf der Scheibenoberfläche zu entfernen. Es ist erwähnenswert, dass die Fähigkeit, zwischen gesunden und ungesunden/toten Neuronen zu unterscheiden, von größter Bedeutung für eine gute Abdichtung und stabile Aufzeichnung ist. Ein krankes/totes Neuron hat ein geschwollenes oder geschrumpftes Aussehen zusammen mit einem sichtbaren großen Kern, während ein gesundes Neuron durch eine 3-dimensionale (3D) Form mit einer hellen und glatten Membran gekennzeichnet ist und sein Kern unsichtbar ist. Um eine Ganzzellkonfiguration zu erreichen, ist es unerlässlich, schnelle oder langsame Kapazitäten bei Bedarf Schritt für Schritt zu kompensieren. Bei Raumtemperatur (RT) wird das Sperrschichtpotential mit 15,1–15,2 Millivolt (mV) und 4,3–4,4 mV in K+-basierten bzw. Cs+-basierten intrazellulären Lösungen berechnet. In unseren Studien wurden die aufgezeichneten Daten nicht um das Fluidübergangspotenzial korrigiert.
- Erfassung von intrinsischen Membraneigenschaften
- Aufzeichnen der Feuereigenschaften: Testen Sie das Feuermuster jedes Neurons in der Stromzange mit einer Reihe von 1 s depolarisierenden Stromimpulsen (25–150 Pikoampere (pA) mit 25 pA-Schritten) bei RMP. Messen Sie den Schwellenwert, die Amplitude und die halbe Breite eines einzelnen Aktionspotentials offline.
Tabelle 1: Rezept für ACSF
kg
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| Bestandteil | Molekulargewicht | Konzentration (mM) | g/L |
| NaCl | 58,5 | Nr. 117 | 6,84 |
| Kcl | 74,5 | 3,6 | 0,27 |
| NaH2PO4·2H2O | Nr. 156 | 1.2 | 0,19 |
| CaCl2·2H2O | Nr. 147 | 2,5 | 0,37 |
| MgCl2·6H2O | Nr. 203 | 1.2 | 0,24 |
| NaHCO3 | 84 | 25 | 2.1 |
| D-Glukose | 180 | 11 | 1,98 |
| Ascorbinsäure | 198,11 | 0,4 | 0,08 |
| Natriumpyruvat | Nr. 110 | arabische Ziffer | 0,22 |
Tabelle 2: Rezept für K+-basierte intrazelluläre Lösung
kg
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Uhr
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kg
kg
kg
kg
| Bestandteil | Molekulargewicht | Konzentration (mM) | mg/100 mL |
| K-Gluconat | 234,2 | Nr. 130 | 3044,6 |
| Kcl | 74,5 | 5 | 37,28 |
| Na2-Phosphokreatin | 453,38 | 10 | 453,38 |
| EGTA (EGTA) | 380,35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238,31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507,18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523,18 | 0,3 | 15,7 |
Tabelle 3: Rezept für Cs+-basierte intrazelluläre Lösung
kg
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kg
Uhr
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kg
kg
kg
kg
kg
| Bestandteil | Molekulargewicht | Konzentration (mM) | mg/100 mL |
| CsMeSO4 | 228 | 92 | 2097,6 |
| CsCl | 168,36 | Nr. 43 | 723,95 |
| Na2-Phosphokreatin | 453,38 | 10 | 453,38 |
| TEA-Cl | 165,71 | 5 | 82,86 |
| EGTA (EGTA) | 380,35 | 0,5 | 19.02 |
| HEPES | 238,31 | 10 | 238,3 |
| Mg-ATP | 507,18 | 4 | 202,9 |
| Li-GTP | 523,18 | 0,3 | 15,7 |
