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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitungen
- Entwerfen und bauen Sie ein geeignetes Einführwerkzeug, das die Silikonsonde und den Elektrodenanschluss während des Implantationsprozesses vorübergehend trägt. In Abbildung 1 finden Sie ein Beispiel für ein benutzerdefiniertes Einfügewerkzeug.
- Lösen Sie die Silikonsonde und den Elektrodenstecker vorsichtig mit einer Zange mit Keramikspitze aus der Verpackung.
- Heben Sie die Anschlussplatine an und befestigen Sie sie sicher mit einer Krokodilklemme, die an einem Ständer befestigt ist.
- Richten Sie die Sonde mit einem Stereoskop mit einer Zange mit Keramikspitze auf das Einführwerkzeug aus. Tragen Sie eine ~2 mm dicke Schicht Paraffinwachs auf, das mit einem Kauterisator geschmolzen wurde, um die Sonde auf das Einführwerkzeug zu kleben. Achten Sie darauf, dass Sie die Sondenschäfte während dieses Vorgangs nicht berühren.
- Befestigen Sie den Elektrodenstecker mit handelsüblichem Klebeband am Schaft des Einführwerkzeugs. Beachten Sie, dass je nach Hersteller Erdungskabel vor der Implantation an die Elektrodenanschlussplatine gelötet werden müssen. Entfernen Sie die Isolierung von zwei kurzen Stücken lackisoliertem Kupferdraht mit Zinnlot, das mit einem Lötkolben (400 °C) aufgetragen wird. Löten Sie die Erdungskabel in die entsprechenden Schlitze in der Elektrodenanschlussplatine.
- Entfernen Sie die Isolierung von zwei zusätzlichen Kupferdrahtstücken. Wickeln Sie jeden blanken Kupferdraht dreimal um eine Edelstahlschraube (1 mm Durchmesser, 2 mm Länge). Tragen Sie ein zum Löten von Stahl geeignetes Flussmittel auf und löten Sie den Kupferdraht an die Unterseite des Schraubverschlusses. Achten Sie darauf, dass die untere Hälfte des Schraubgewindes frei von Zinnlot bleibt.
- Verwenden Sie ein Standardmultimeter, um den elektrischen Kontakt zwischen Draht und Schraube zu überprüfen.
- Desinfizieren Sie die Schäfte der Silikonsonde und die Schraubfundamente durch Eintauchen in 70%iges Ethanol (10 s).
- Bereiten Sie eine Schutzhülle für das Sondenimplantat vor, indem Sie den Kopf einer Pasteurpipette aus Kunststoff in zwei Hälften schneiden.
>2. Implantationschirurgie
- Sterilisieren Sie chirurgische Instrumente (Scheren, Pinzetten mit feiner Spitze, chirurgische Klemmen) mit einem Heißperlensterilisator. Wischen Sie alle Oberflächen mit 70% Ethanol ab.
- Induzieren Sie eine Anästhesie mit 3% Isofluran in Sauerstoff, die mit ~1 l/min abgegeben wird.
- Verwenden Sie zur Aufrechterhaltung 1 - 1,5 % Isofluran. Beachten Sie, dass die Isoflurankonzentration, die zum Erreichen einer chirurgischen Toleranz erforderlich ist, von Tier zu Tier variieren kann.
- Eine stabile chirurgische Toleranz wird erreicht, wenn das Tier nicht auf das Einklemmen der Zehen reagiert. Überwachen Sie die Atemfrequenz der Maus und passen Sie die Konzentration von Isofluran bei Bedarf an.
- Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen zu verhindern.
- Montieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen, indem Sie die Ohrbügel vorsichtig in den Gehörgang einführen. Sobald der Kopf der Maus durch die Ohrstangen stabilisiert ist, legen Sie ein Mundstück über die Schnauze, um eine kontinuierliche Isofluranabgabe zu gewährleisten. Legen Sie die Maus auf ein Handtuch oder Pad über ein Heizkissen und injizieren Sie Buprenorphin subkutan (0,05 - 0,1 mg/kg Körpergewicht), um eine postoperative Analgesie zu gewährleisten.
- Rasieren Sie den Kopf mit einem handelsüblichen Rasierer und desinfizieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in die Haut entlang der Mittellinie des Schädels und öffnen Sie die Haut mit chirurgischen Klammern.
- Richten Sie den Kopf des Tieres mit Hilfe eines stereotaktischen Ausrichtungswerkzeugs aus, um Bregma und Lambda zu nivellieren. Zwischen Bregma und Lambda sollte ein Höhenversatz von weniger als 50 μm vorhanden sein. Nivellieren Sie außerdem den Kopf entlang der mediolateralen Achse, indem Sie die Tiefe von Bregma an der Schädeloberfläche in definierten Abständen links und rechts messen (z. B. 1 mm links und rechts von Bregma). Passen Sie bei Bedarf die Neigung des Kopfes an.
- Reinigen Sie den Kopf mit 3% Wasserstoffperoxid und wischen Sie ihn mit sterilen Wattetüchern trocken.
- Bestimmen Sie die Lokalisation des Kraniotomies relativ zum Bregma mit Hilfe eines geeigneten stereotaktischen Atlas.
- Bohren Sie mit einem 0,9-mm-Bohrkopf zwei Schraubenlöcher in den Knochen über dem Kleinhirn, um Masse- und Referenzschrauben zu platzieren. Zusätzlich sind 1 - 3 Löcher für Verankerungsschrauben wünschenswert, um das Implantat zu stabilisieren. Die Position der Ankerschrauben hängt von der Lage der Kraniotomie ab. Für die Implantation in den Hippocampus werden Ankerschrauben über den kontralateralen parietalen und ipsilateralen frontalen Kortex gelegt. Setzen Sie die Schrauben mit einem geeigneten Schraubendreher in den Knochen ein. Achten Sie darauf, nicht in das Gehirn einzudringen.
- Führen Sie die Kraniotomie durch, indem Sie den Schädel mit dem Bohrer in einem rechteckigen Bereich um die Implantationsseite langsam ausdünnen. Befeuchten Sie den Knochen häufig mit sterilisiertem Phosphatpuffer (PB). Der verbleibende ausgedünnte Schädel kann mit Hilfe einer feinen (27G) Injektionsnadel und einer Pinzette vorsichtig durchstochen und entfernt werden.
- Stechen Sie die Dura Mater vorsichtig mit einer dünnen (27G) Injektionsnadel ein. Forme einen kleinen Haken, indem du die Spitze der Nadel mit einer Pinzette biegst und die Dura zum Entfernen ziehst. Tragen Sie PB auf, um ein Austrocknen der Gehirnoberfläche zu verhindern.
- Montieren Sie das Elektrodeneinführwerkzeug auf einer stereotaktischen Halterung, stellen Sie die Sonde auf Bregma auf Null und bewegen Sie die Sonde über der Kraniotomie zu den stereotaktischen Koordinaten. Dringen Sie langsam in die Gehirnoberfläche ein. Stellen Sie sicher, dass sich die Sondenschäfte nicht verbiegen. Vermeiden Sie die Implantation durch Blutgefäße.
- Senken Sie die Sonde langsam bis ~200 μm über die gewünschte Tiefe. Decken Sie die Kraniotomie und die Schäfte der Silikonsonde zum Schutz mit sterilisierter Vaseline ab. Tragen Sie Zahnzement auf, um die Basis der Sonde an der Verankerungsschraube im Schädel zu befestigen.
- Bewegen Sie die Sonde direkt nach dem Zementauftrag langsam auf die Zieltiefe. Das Vorschieben der letzten ~200 μm nach dem Auftragen des Zements reduziert die seitliche Bewegung der Sonde und sorgt für eine minimale Gewebeschädigung im Zielbereich. Beachten Sie, dass die Aushärtungszeit des verwendeten Zements diesen Schritt des Protokolls beeinflussen kann. Bei schnell aushärtendem Zement entfällt dieser Schritt und implantieren Sie die Sonde direkt in die Zieltiefe, um eine Beschädigung der Silikonsonde zu vermeiden.
- Nachdem der Zement ausgehärtet ist, lösen Sie die Sonde vom Einführwerkzeug, indem Sie das Wachs mit einem Kauterisator schmelzen.
- Lösen Sie die Anschlussplatine von der Einführvorrichtung und positionieren Sie sie mit einer am Einführgriff befestigten Krokodilklemme an einer geeigneten Stelle am Schädel. Im Falle einer Sondenimplantation in den Hippocampus wird die Verbindungsplatine auf den kontralateralen Parietalknochen aufgesetzt. Befestigen Sie die Verbindungsplatte mit Zahnzement am Schädel.
- Löten Sie die Erdungs- und Referenzdrähte der Anschlussplatine an die Drähte, die an den beiden Schrauben über dem Kleinhirn befestigt sind.
- Schneiden Sie die Schutzabdeckung auf die richtige Höhe ab und legen Sie sie über die Silikonsonde. Befestigen Sie die Abdeckung mit Zahnzement an der Verbindungsplatine und dem Schädel, wobei Sie die Haut um den freiliegenden Schädel herum vermeiden sollten. Ein Vernähen der Haut um die Implantationsstelle ist in der Regel nicht erforderlich.
>3. Genesung nach der Operation
- Wenden Sie mindestens 2 Tage lang eine geeignete analgetische Behandlung an (z. B. subkutane Injektionen von Buprenorphin alle 6 h tagsüber und in das Trinkwasser über Nacht in Kombination mit Carprofen (4 - 5 mg/kg Körpergewicht) subkutan alle 24 h). Es wird empfohlen, ein einzelnes Gehäuse zu verwenden, um Schäden am Implantat zu vermeiden.
- Warten Sie mindestens eine Woche für die Genesung. Konsultieren Sie die örtlichen Tierschutzrichtlinien.
>4. Datenerfassung
- Aufzeichnung von LFPs von frei beweglichen Mäusen mit einem geeigneten Datenerfassungssystem, das über einen Kommutator verbunden ist. Um LFPs zu erfassen, verwenden Sie eine Abtastfrequenz von 1 - 5 kHz. Höhere Abtastraten (20 - 30 kHz) sind erforderlich, wenn Einzelentladungen zusammen mit dem LFP aufgezeichnet werden sollen.
- Speichern Sie rohe Aufnahmedateien der einzelnen Kanäle für die Offline-Analyse.
