Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung der experimentellen Lösung
- Bereiten Sie die Präparierlösung 1 Tag bis 1 Woche vor dem eigentlichen Experiment vor. Verwenden Sie für die Netzhautdissektion eine 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)-Pufferlösung, da sie bei niedrigeren Temperaturen eine starke Pufferfähigkeit aufweist16. Alle Chemikalien wie folgt (in mM) mischen: 115 NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 1,0 MgCl2, 10 HEPES, 28 Glukose. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,4 ein. Bewahren Sie die Lösung bis zu 1 Woche im Kühlschrank auf.
- Die Aufzeichnungslösung ist Ames' Medium, eine künstliche zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (aCSF), die für Netzhautpräparationen entwickelt wurde. Am Tag des Versuchs wird das Ames-Pulver (4,4 g für 500 ml Lösung) in einem Röhrchen abgewogen. NaHCO3 (0,95 g pro 500 ml Lösung) abwiegen und mit dem Ames-Pulver mischen.
- Bereiten Sie die intrazelluläre Pipettenlösung für die Patch-Clamp-Aufzeichnungen bis zum Tag des Experiments vor. Mischen Sie alle Chemikalien wie folgt (in mM): 111 K-Gluconat, 1,0 CaCl2, 10 HEPES, 1,1 Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), 10 NaCl, 1,0 MgCl2, 5 ATP-Mg und 1,0 GTP-Na. Stellen Sie den pH-Wert mit KOH auf 7,2 ein. Filtrieren Sie die Pipettenlösung mit einem herkömmlichen Spritzenvorsatzfilter. Stellen Sie ~500 μl Aliquots her und lagern Sie sie in einem Gefrierschrank oder einer Tiefkühltruhe.
>2. Vorbereitung auf den Experimentiertag
- Setzen Sie eine Maus in der Nacht vor dem Experiment in einen Käfig (C57BL/6J oder ähnlicher Hintergrund, 4 - 8 Wochen alt, männlich) an einen dunklen Raum für die Dunkeladaption über Nacht (O/N).
- Vorbereitung für die Präparierung:
- Die Präparierlösung (100 - 200 ml) in ein Becherglas füllen, auf Eis legen und mindestens 10 min mit Sauerstoff sprudeln lassen.
- Starten Sie die Sauerstoffversorgung der dunklen Box für die Aufbewahrung der Netzhautpräparation.
- Bereiten Sie Kunststoff-Deckgläser mit Fettschienen für die Vorbereitung von Netzhautschnitten vor und legen Sie sie jeweils in eine 35-mm-Kunststoffschale.
- Befestigen Sie eine neue Rasierklinge an einem Zerkleinerer (Tissue-Slicer).
- Schneiden Sie eine Filtermembran in zwei Hälften. Dies ist für das Schneiden der Netzhaut.
- Richten Sie die Präparierwerkzeuge und Transferpipetten in der Nähe des Präpariermikroskops aus. Der Arbeitsbereich muss gut organisiert sein, damit jedes Werkzeug auch im Dunkeln leicht zugänglich ist.
- Vorbereitung für Patch Clamp Aufnahmen:
- Ames-Pulver und NaHCO3 werden in destilliertem Wasser gelöst (Ames 4,4 g und NaHCO3 0,95 g/500 ml ddH2O). Blasen Sie das Ames-Medium mindestens 30 Minuten lang mit gemischtem Sauerstoff (95 %O2 und 5 % CO2) und erhitzen Sie es dabei auf ein Aufnahmetemperaturniveau (~35 °C). Stellen Sie den pH-Wert mit NaHCO3 auf 7,4 ein, während es noch sprudelt.
- Tauen Sie die innere Pipettenlösung während der Dissektion auf. Nach dem Auftauen 0,01 % Sulforhodamin B für die intrazelluläre Färbung hinzufügen.
>3. Patch Clamp-Aufnahmen von der Vorbereitung von Netzhautschnitten
- Vorbereitung der Aufnahmen:
- Grundieren Sie die Perfusionsschläuche mit Ames-Medium. Lassen Sie alle Blasen durch, wenn Sie den Schlauch füllen.
- Stellen Sie Patch-Clamp-Aufnahmepipetten mit einem Abzieher her. Um eine Pipette mit der Pipettenlösung zu füllen, tauchen Sie die Rückseite einer Pipette 1 Minute lang ein, bis die Pipettenspitze verfüllt ist. Füllen Sie anschließend ~1/3 der Pipette mit einem Mikropipettenfüller. Bewahren Sie jede Pipette in einem feuchten Pipettenkasten auf.
- Schalten Sie die Ausrüstung für Patch-Clamp-Aufnahmen ein, einschließlich Computer, Verstärker, CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) und Mikroskop.
- Schalten Sie das Raumlicht aus. Legen Sie eine Netzhautschnittvorbereitung mit einem Infrarotbetrachter auf die Tischkammer des Mikroskops. Nachdem es immobilisiert ist, beginnen Sie mit der kontinuierlichen Perfusion. Stellen Sie die Perfusionstemperatur auf 33 bis 37 °C ein.
- Betrachten Sie die Schnittoberfläche mit der CCD-Kamera. Konzentrieren Sie sich auf die Zielposition, an der sich die Zielzelltypen befinden. Wählen Sie eine gesund aussehende Zelle für die Patch-Clamp-Aufzeichnung aus (d. h. sie sollte eine glatt aussehende Oberfläche und eine gute Zellform haben).
- Setzen Sie eine Aufzeichnungspipette in einen Pipettenhalter ein. Schieben Sie die Pipette zur Scheibenvorbereitung vor. Wenn es sich in der Nähe der Schnittvorbereitung befindet (~2 mm oben), suchen Sie die Spitze der Pipette mit dem Mikroskop. Sobald die Pipettenspitze unter dem Mikroskop sichtbar ist, bewegen Sie die Spitze nach unten in Richtung der Zielzelle.
- Stellen Sie den Verstärker ein. Stellen Sie die Pipette auf 0 mV/0 pA ein (Nullstellung) und starten Sie einen kontinuierlichen elektrischen Impuls von ~5 mV bei ~10 Hz. Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand; Der ideale Widerstand liegt zwischen 5 und 10 MΩ für die meisten retinalen Neuronen.
- Beginne mit dem Ausblasen aus der Spitze. Verwenden Sie ein Mundstück oder eine Spritze, um Überdruck auszuüben, wenn die Pipette in die Badlösung eintaucht. Blasen Sie die innere Lösung kontinuierlich aus, bis sich die Spitze auf der Oberfläche der Zielzelle befindet.
- Wenn der Überdruck ein kleines Grübchen auf der Zelloberfläche hinterlässt, schieben Sie die Spitze leicht nach vorne und hören Sie auf zu blasen. Überprüfen Sie den Pipettenwiderstand, der zunehmen sollte. Wenn er kontinuierlich ansteigt, lassen Sie ihn stehen und überwachen Sie den Widerstand, bis er >1 GΩ (Gigaseal) erreicht. Wenn der Widerstand nicht spontan zunimmt, üben Sie vorsichtig Unterdruck aus, bis er zu einem Gigaseal wird.
- Nachdem die Gigadichtung erreicht ist, ändern Sie das Haltepotenzial auf -70 mV. Üben Sie dann intermittierend Unterdruck aus, um die Membran in der Pipettenspitze zu zerreißen. Wenn die Ganzzellkonfiguration vorgenommen wird, kann der Pipettenwiderstand zwischen 500 MΩ und 1 GΩ liegen, und der kapazitive Strom wird gesehen. Manchmal können spontane postsynaptische Ströme beobachtet werden.
- Erfassen Sie das Strom-Spannungs-Verhältnis (I-V) von -80 bis +40 mV. Je nach Zelltyp werden unterschiedliche Arten von spannungsgesteuerten Kanälen aktiviert.
- Erfassen Sie lichtevozierte synaptische Ströme oder Spannungen.
