Subdurale Implantation eines weichen Elektrokortikographie-Arrays zur kortikalen Elektrophysiologie-Aufzeichnung bei Minipigs

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom örtlichen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

1. Chirurgische Implantation von Arrays für die weiche Elektrokortikographie (ECoG)

1. Anästhesie
   1. Prämedikation: Die Göttinger Minischweine (n = 7) im Alter von 2-6 Monaten (5-8 kg) isolieren und über Nacht fasten. Injizieren Sie eine Mischung aus Midazolam mit 0,75 mg/kg, Atropin mit 0,25 μg/kg und Haldol mit 0,1 mg/kg intradermal und warten Sie, bis das Tier sediert ist. Wiegen Sie das Tier, bevor Sie fortfahren.
   2. Installation von intravenöser (IV) Elektrode:
      1. Legen Sie das Tier auf den Operationstisch auf ein Heizkissen. Induzieren Sie eine Anästhesie, indem Sie eine Gesichtsmaske auf das Tier auftragen und dabei Sevofluran in einem Verhältnis von 3 % bis 3,5 % verwenden.
      2. Platzieren Sie Elektrokardiogramm-Elektroden am Bauch, einen Blutsättigungssensor am Schwanz und einen Temperatursensor am Nasenloch.
      3. Legen Sie eine Infusionselektrode auf eine Ohrvene und bestätigen Sie den Blutzugang mit einer mit Kochsalzlösung gefüllten Spritze. Stellen Sie sicher, dass die Augen mit Feuchtigkeit versorgt werden, indem Sie Salbe verwenden.
   3. Intubation: Injizieren Sie einen Bolus aus Atracurium mit 0,5 mg/kg, Ketamin mit 1 mg/kg und Fentanyl mit 1-2 μg/kg. Legen Sie das Tier zur Intubation auf den Rücken. Setzen Sie einen 4,5-mm-Schlauch ein.
   4. Medikation: Beenden Sie nach der Intubation die Sevofluran-Anästhesie und installieren Sie eine Propofol-Infusion mit 10 mg/kg/h, Fentanyl mit 2 μg/kg/h, Atracurium mit 0,2-0,5 mg/kg/h und Kochsalzlösung mit 4-7 mg/kg/h. Beginnen Sie eine Infusion von Mannitol mit 1 g/kg/h, um die Schwellung des Gehirns während der Operation zu reduzieren.
      HINWEIS: Eine multimodale Analgesietherapie kann angewendet werden, wenn dies von der örtlichen Tierethikkommission empfohlen wird.
2. Aseptische Feld- und Hautvorbereitung: Rasieren Sie die gesamte Oberfläche des Kopfes über das Operationsfeld hinaus. Schrubben Sie den Kopf mit einem sterilen Pad gründlich mit Betadin. Legen Sie anschließend sterile Abdeckungen auf den Instrumententisch und auf das Tier, so dass nur das Operationsfenster freigelegt wird. Zum Schluss schrubben Sie den Kopf erneut mit einem sterilen Pad mit Betadin.
3. Kraniotomie und Durotomie
   1. Hautschnitt: Schneiden Sie die Haut mit einem Skalpellmesser entlang der Mittellinie ein. Trennen Sie den Muskel und das Periost (25 mm lateral vom Bregma auf beiden Seiten und 40 mm vorne und hinten vom Bregma) mit einem Raspatorium vom Knochen und platzieren Sie Spreizer, um einen optimalen Zugang für spätere Bohrungen zu erhalten.
   2. Messungen und Markierung: Identifizieren Sie Bregma und Lambda und markieren Sie sie mit einem sterilen chirurgischen Pen (Abbildung 1A, B). Definieren Sie mit einem sterilen Lineal den Umriss des Knochenlappens, der auf beiden Hemisphären um das Implantationsziel zentriert ist. In diesem speziellen Fall wurde der auditorische Kortex gewählt, mit den Koordinaten -5 mm bis -15 mm vom Bregma und -4 mm bis -20 mm lateral. Passen Sie dann die Kraniotomie an die Größe des Implantats und der anatomischen Orientierungspunkte an, um die Öffnungsgröße zu begrenzen.
   3. Kraniotomie:
      1. Bohren Sie mit einem Knochenbohrer mit einem runden Schneidbohrer den Umriss der Kraniotomie unter Berücksichtigung der Dicke des Schädels. Spülen Sie die Bohrstelle mit Kochsalzlösung, um eine Überhitzung des Knochens zu vermeiden.
      2. Den Umriss vorsichtig gleichmäßig anbohren, bis er die Dura mater erreicht. Beim ersten Durchbruch bohren Sie die Kontur so lange fertig, dass sie fast durchbricht. Verwenden Sie dann einen flachen Spatel (entweder auf der Mittellinie oder auf der lateralen Seite), um den Knochenlappen in einem Stück abzubrechen, indem Sie den Kraniotomierand als Hebel verwenden. Wenn zu viel Widerstand auftritt, dünnen Sie den Knochen weiter aus.
      3. Legen Sie das Knochenstück in sterile Kochsalzlösung.
      4. Sobald der Knochenlappen entfernt ist, schlagen Sie den Rand der Kraniotomie vorsichtig ab und verwenden Sie ein Kerison, um zu verhindern, dass die scharfe Knochenkante in die Dura mater schneidet.
      5. Wenn übermäßige Blutungen an der Dura mater oder am Knochen auftreten, verwenden Sie Gelfoam bzw. Knochenwachs. Legen Sie eine feuchte Kompresse (Standard-Pad in steriler Kochsalzlösung) in den Kraniotomie und wiederholen Sie diesen Schritt auf der anderen Hemisphäre (Abbildung 1B).
   4. Durotomie:
      1. Mit der Nadel aus einem Nahtset 6-0 stechen und heben Sie vorsichtig die Dura mater am vorderen oder hinteren Ende der Kraniotomie auf halbem Weg zwischen der medialen und lateralen Seite an und erstellen Sie den Beginn eines Schnitts mit dem Stichmesser.
      2. Erzeugen Sie dann mit einem kleinen flachen Spatel, der als Schneidbasis in den Subduralraum eingeführt wird, um die Hirnrinde zu schützen, einen anteroposterioren Schlitz in der Dura mater, indem Sie gleichzeitig mit beiden Werkzeugen vorrücken. Achten Sie darauf, dass der Schlitz etwas größer als die Breite des Implantats ist (Abbildung 1C). Wenn bei diesem Schritt Blutungen oder Schäden auftreten, bedecken Sie ihn mit Gelschaum und warten Sie, bis er aufhört.
         HINWEIS: Die Schlitzbahn sollte angepasst werden, wenn große Blutgefäße in der Dura mater vorhanden sind, um Blutungen zu vermeiden.
4. Implantat
   1. Einsetzen des Geräts:
      1. Spülen Sie das Implantat (Abbildung 2A) auf beiden Seiten mit Kochsalzlösung, damit es leichter in den Subduralraum gleitet. Platzieren Sie das Implantat über dem Dura-Mater-Schlitz und führen Sie das Gerät mit einer kleinen Pinzette subdural ein, indem Sie es nacheinander an jeder Kante verschieben.
      2. Halten Sie das Sockelende des Geräts vorsichtig fest und schieben Sie das Implantat voran, um keine Spannungen zu erzeugen, die das Einsetzen behindern. Wenn sich die Verbindungskante oben auf dem Schlitz befindet, stoppen Sie das Einstecken.
   2. Sichern Sie das Implantat: Um das Implantat zu sichern, legen Sie nach dem Rand der Kraniotomie oder in den Verankerungsflügeln eine Titanbrücke über das Kabel und befestigen Sie diese mit einer oder zwei Titanschrauben mit dem entsprechenden Schraubendreher (Abbildung 1D).
   3. Erdungsplatzierung: Entfernen Sie vorsichtig 1 cm der Isolierung der Erdungsdrähte und führen Sie sie epidural am hinteren Ende der Kraniotomie (oder an einer anderen Stelle der Epiduralanästhesie, die weit von der interessierenden Rinde oder den großen Blutgefäßen entfernt ist) ein (Draht in Abbildung 1E)
   4. Wiederholen Sie die Schritte auf der kontralateralen Hemisphäre.
   5. Dura mater-Verschluss: Die Dura mater vorsichtig mit einer 3-0 resorbierbaren Naht und einem kleinen Nadelhalter um das Implantatkabel nähen. Bringen Sie die beiden Dura mater-Ränder so weit wie möglich zusammen, ohne die dünne Membran mit dem Nahtdraht zu durchreißen (Abbildung 1D, E).
   6. Platzierung des Knochenlappens: Befestigen Sie eine Titanbrücke am vorderen und hinteren Teil jedes Knochenlappens mit einer Titanschraube. Achten Sie darauf, die Positionierung der Ti-Brücken in den nächsten Schritten in Bezug auf die Platzierung der Fußplattenbeine zu planen. Schrauben Sie das Ende der Titanbrücken mit dem Schädel an (Abbildung 1F, G).
5. Platzierung des Sockels und der Fußplatte
   1. Positionierung: In dieser Konfiguration hat die Fußplatte sechs Beine mit je zwei Schraubenlöchern (Abbildung 2B). Planen Sie die Platzierung der Fußplatte auf dem Schädel, um die Position der Schrauben zu optimieren (vermeiden Sie es, sie am Rand der Kraniotomie oder im Schläfenmuskel zu platzieren). Überspringen Sie die Löcher in den Beinen, wenn sie sich nicht einschrauben lassen.
   2. Sicherung der Fußplatte: Schrauben Sie die Titanschrauben der Fußplatte ein, bis sie fest sitzt (siehe Abbildung 1H).
   3. Platzierung des Sockels: Entfernen Sie die Titanbrücken über den Verbindungskabeln und klappen Sie den Sockel um, um auf der Fußplatte zu landen. Schrauben Sie den Sockel auf die Fußplatte. Vergewissern Sie sich, dass der Sockel fest sitzt (Abbildung 1I).
6. Naht und Verschluss
   1. Reinigung der Wunde: Reinigen Sie den Unterhautraum von Knochen oder anderen Ablagerungen, indem Sie ihn mit Kochsalzlösung spülen. Schneiden Sie etwas Haut um die Sockelkanten herum ab, um eine runde Kante zu erhalten, die dem Zylinder folgt.
   2. Subkutane Nähte: Entfernen Sie die Spreizer und falten Sie die Hautlappen zusammen. Erstellen Sie subkutane Nähte mit einem nicht resorbierbaren Nahtdraht 4-0 im Abstand von 3 mm unter Verwendung einfacher unterbrochener Nähte oder einfacher kontinuierlicher Nähte. Beginnen Sie vom Sockel weg und bewegen Sie sich auf beiden Seiten des Schnitts auf ihn zu.
   3. Hautnähte: Naht die Haut mit einem nicht resorbierbaren Nahtdraht 6-0 mit Nähten im Abstand von 5 mm. Beginnen Sie vom Sockel weg und bewegen Sie sich auf beiden Seiten des Schnitts auf ihn zu. Achten Sie darauf, dass zwischen den beiden Hautlappen und in der Nähe des Sockelrandes eine gute Gewebeanlagerung erreicht wird, um einen Hohlraum zu vermeiden (Abbildung 1J).
   4. Wundverband: Reinigen Sie den Wundbereich erneut mit einem sterilen Pad und Betadine. Legen Sie einen selbstklebenden sterilen Verband über die Wunde.
7. Erwachen: Nachdem alle Messungen durchgeführt wurden, nehmen Sie das Tier von allen Narkosemitteln, aber halten Sie es unter Beatmung. Zur Analgesie tragen Sie ein Buprenorphin-Pflaster (25 mg/h) für 24 Stunden auf. Legen Sie das Tier auf ein Heizkissen, das mit Vorhängen bedeckt ist, um die Weckzeit zu beschleunigen. Wenn die Spontanatmung wiederhergestellt ist, extubieren Sie das Tier und legen Sie es unter eine Sauerstoff-Gesichtsmaske, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist (was 1 bis 4 Stunden dauern kann).
8. Postoperative Tierpflege: Halten Sie das Tier 5 Tage lang streng unter Beobachtung. Geben Sie zweimal täglich eine Dosis Cephalexin von 75 mg zum Futter, getrennt von anderen Tieren. Führen Sie täglich eine Desinfektion der Wunde durch, indem Sie große Mengen Betadin mit eingeweichten sterilen Pads auftragen (am besten während der Fütterung).
   HINWEIS: Langzeitpflege und Unterbringung: Das operierte Tier wird 24 Stunden lang isoliert gehalten. Es wird in seine ursprüngliche soziale Gruppe zurückversetzt, wenn es dem Tier gut genug geht, um sozial mit seinen Artgenossen zu interagieren. Eine tägliche Beobachtung des Sockels und der Hautöffnung muss durchgeführt werden, um die Integration des Geräts auf dem Kopf zu verfolgen. Reinigen Sie gegebenenfalls die Stelle um den Sockel herum mit reichlich Betadin.

2. Elektrophysiologische Aufzeichnung

1. Spontane Aktivität: Schließen Sie das drahtlose Aufzeichnungssystem an den Sockel an und zeichnen Sie die Grundaktivität 2-3 Minuten lang auf. Diese Aufnahmen dienen als Kontrolle, um die auditiv evozierten Potentiale zu analysieren.
2. Auditiv evozierte Potentiale: Setzen Sie zusätzlich zum Funksystem Lautsprecher in einem geschlossenen Feld in die Tierohren ein. Spielen Sie akustische Stimulation mit Tone-Burst bei verschiedenen Frequenzen (von 200-20.000 Hz) bei einem Schalldruckpegel (SPL) von etwa 70 dB über 120 Wiederholungen ab. Mitteln Sie dann die Aufnahmen und richten Sie sie zur Analyse über die Stimulusperiode aus.
3. Sensorisch evozierte Potentiale: Platzieren Sie die Nadeln in der Schnauze an drei verschiedenen Positionen. Evozieren Sie sensorische Potentiale, indem Sie die Schnauze mit dem Impulsgenerator für ~30 s bei verschiedenen Amplituden stimulieren, um die Rekrutierungskurven zu erhalten.

3. Frei bewegliche Aufnahme

1. Befolgen Sie das gleiche Verfahren, das in Abschnitt 2 beschrieben wurde, um Wachsignale vom Gehirn aufzuzeichnen. Schließen Sie den drahtlosen Kopftisch an, indem Sie das Tier entweder in den Armen des Experimentators halten oder das Tier mit Leckerlis füttern, um es abzulenken. Sorgen Sie für die akustische Stimulation mit externen Lautsprechern, die in der Nähe des Tieres platziert sind.

Abbildung 1: Minimalinvasive Implantation von weichem ECoG in das Gehirn. (A) Chirurgischer Zugang zum Schädel, mit Indikation eines Bregmas. (B) Bilaterale Kraniotomie mit sichtbarer Dura mater. (C) Schlitzdurotomie an der ersten Hemisphäre. (D) Subdurale Implantation von weichem ECoG und Dura mater-Verschluss. (E) Schlitzdurotomie an der zweiten Hemisphäre. Fixierung des Knochenlappens auf der ersten Hemisphäre mit Hilfe von Titanbrücken. (F) Implantation von weichem ECoG auf der zweiten Hemisphäre und Dura mater-Verschluss. (G) Fixation des Knochenlappens auf der zweiten Hemisphäre. (H) Positionierung der Fußplatte auf dem Schädel. (Ich) Fixierung des Sockels auf der Fußplatte. (J) Hautverschluss um den Sockelfuß.

Abbildung 2: MRT-fähiger Sockel. (A) Chronisches MRT-kompatibles transdermales Verbindungssystem (Sockel) für den Zugang zum weichen Elektrodenarray. (B) Sockel mit Elektroden auf der Fußplatte zur Verankerung des Schädels. Einschub: Details der Fußplatte.