Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Transkardiale Perfusion
- Hängen Sie eine Spritze mit einem Fassungsvermögen von 60 ml als Reservoir für Saccharose-Schneidlösung etwa 18 Zoll über der Tischplatte auf (z. B. mit einer dreizackigen Drehklemme an einem vertikalen Pfosten). Befestigen Sie den Schlauch am Boden des Behälters, führen Sie den Schlauch durch eine Rollenklemme und verbinden Sie das andere Ende des Schlauchs mit einer sauberen 20-G-Nadel.
- Füllen Sie das 60-ml-Reservoir mit ca. 30 mL gekühlter Saccharoselösung und leiten Sie eine Carbogen-Leitung in das Saccharose-Reservoir, um das Perfusat kontinuierlich blasen zu lassen.
Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Saccharose ohne eingeschlossene Blasen durch den Schlauch und die Nadel fließt. Die Durchflussrate sollte gerade schnell genug sein, um einen gleichmäßigen, kontinuierlichen Strom von tropfender Saccharose aus der Nadel zu haben.
- Mit einem Mixer die gefrorene Saccharose zerkleinern und zu einer eiskalten Aufschlämmung pürieren und mit dem großen Spatel/Löffel die Aufschlämmung verteilen.
- Geben Sie eine kleine Menge Saccharose-Aufschlämmung um die Ränder des Deckels der Petrischale des Glases. Geben Sie eine kleine Menge Saccharose-Aufschlämmung auf den Boden der Petrischale.
- Geben Sie etwa 20–30 ml Saccharose-Aufschlämmung in das Perfusionsflüssigkeitsreservoir und mischen Sie es gut mit den 30 mL gekühlter flüssiger Saccharose, bis das Reservoir eine Mischung aus sehr kalter, überwiegend flüssiger Saccharose und etwas gefrorener Lösung enthält.
- Platzieren Sie die Maus in einer Kammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist. Bei einem Sauerstofffluss von ca. 2 l/min drehen Sie den Drehknopf des Verdampfers, um Isofluran in einer Konzentration von 5 % abzugeben, und starten Sie einen Timer.
Anmerkung: Lassen Sie diesen Timer während des Schneidens laufen, um zu messen, wie schnell die Scheiben erhalten werden. Der Eingriff sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, so dass das Schneiden abgeschlossen ist und sich das Gewebe in der Grenzflächenkammer innerhalb von 15 bis 20 Minuten nach dem Eintritt des Tieres in die Isoflurankammer erholt. Beobachten Sie die Maus, um sicherzustellen, dass ein Zustand tiefer Anästhesie erreicht wird. Nach mindestens 5 Minuten sollte die Maus tief betäubt sein und nicht mehr auf Zehenkneifen reagieren.
- Unmittelbar vor der Entnahme der Maus aus der Isoflurankammer füllen Sie den Deckel der Petrischale bis zu einer Tiefe von ca. 3–5 mm mit gekühlter Saccharoselösung und füllen Sie den Boden der Petrischale mit gekühlter Saccharoselösung bis zu einer Tiefe von ca. 1,0 cm.
- Übertragen Sie die Maus schnell auf das linke Saugkissen und verwenden Sie die 3 Stücke Klebeband, um die Vordergliedmaßen und den Schwanz zu sichern. Kneifen Sie die Zehen der Hintergliedmaßen zusammen, um sicherzustellen, dass die Maus nicht reagiert, bevor ein Schnitt durchgeführt wird. Befestigen Sie die Haut mit der großen Gewebezange und der chirurgischen Schere, und machen Sie einen Längsschnitt von der Unterseite des Brustbeins bis zur Oberseite der Brust. Mit der Pinzette das Brustbein nach oben ziehen und mit der Schere das Zwerchfell durchtrennen.
Anmerkung: Die anfängliche Positionierung der Maus und die ersten Schnitte zum Durchtrennen des Zwerchfells sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Maus nicht wieder das Bewusstsein erlangt. Um eine ausreichende Narkosetiefe während des gesamten Eingriffs zu gewährleisten, kann ein Nasenkonus auf die Maus gelegt werden, um während der Perfusion Isofluran zu verabreichen.
- Schneide mit der Schere den Brustkorb auf jeder Seite durch und schneide in einer großen Bewegung auf den Punkt zu, an dem das Vorderglied auf den Körper trifft. Schwingen Sie mit der Pinzette die Vorderseite des Brustkorbs weg und nach oben in Richtung Kopf und entfernen Sie ihn dann mit einem horizontalen Schnitt mit einer großen Schere vollständig. Halten Sie das Herz mit der großen Pinzette fest und führen Sie die 20 G Perfusionsnadel in die linke Herzkammer ein. Sobald die Nadel richtig positioniert ist, sollte die linke Seite des Herzens schnell blassen, da gekühlte Saccharoselösung den Ventrikel füllt.
- Mit der kleinen Dissektorschere in den rechten Vorhof einschneiden und das Blut aus dem Kreislauf abfließen lassen. Wenn die Schnitte korrekt durchgeführt werden, sollte das Herz nur minimal geschädigt werden und es sollte während der gesamten Perfusion weiter pumpen.
Anmerkung: Zusammengerollte Stücke Seidenpapier können verwendet werden, um Blut und Saccharoselösung aus dem Herzen abzuleiten und die Sichtbarkeit der Perfusionsnadel während des Eingriffs zu erhalten.
- Achten Sie darauf, dass die Perfusionsnadel an Ort und Stelle bleibt und nicht aus der linken Herzkammer herausfällt. Bei richtiger Flussrate und Platzierung beginnt die Leber nach 20–30 s zu einer hellbraunen/beigen Farbe zu blassen.
- Nach 30–45 s die Maus mit der großen Schere enthaupten. Halten Sie den Kopf in der linken Hand und schieben oder schälen Sie die Haut vom Schädel weg. Bei einem gut durchbluteten Tier sollte der Schädel sehr blass sein, und das Gehirn sollte durch den Schädel hindurch eine sehr hellrosa Farbe (fast weiß) ohne deutlich sichtbare Blutgefäße erscheinen.
>2. Gehirn extrahieren und Scheiben schneiden
- Machen Sie mit der kleinen Bonner Schere zwei seitliche Schnitte durch den Schädel in Richtung der Mittellinie an der Vorderseite des Schädels, in der Nähe der Augen. Mache zwei weitere Schnitte auf beiden Seiten der Schädelbasis.
- Schieben Sie den Kopf auf den Boden der Petrischale aus Glas, wo er größtenteils in gekühlte Saccharoselösung getaucht werden sollte. Schneiden Sie mit der kleinen Bonner Schere die Mittellinie entlang der Länge des Schädels ab und ziehen Sie sie mit der Schere nach oben, um die Schädigung des darunter liegenden Hirngewebes zu minimieren. Fassen Sie mit der kleinen Gewebezange jede Seite des Schädels fest und schwingen Sie sie nach oben und vom Gehirn weg, wie beim Öffnen eines Buches.
- Halten Sie mit den Fingern der linken Hand die Schädellappen offen und führen Sie den Mikrospatel unter das Gehirn in der Nähe der Riechkolben ein. Drehen Sie das Gehirn aus dem Schädel in die Saccharose und verwenden Sie den Mikrospatel, um den Hirnstamm zu durchtrennen. Waschen Sie das Gehirn, um Blutreste, Fell oder anderes Gewebe zu entfernen.
- Verwenden Sie den großen Spatel/Löffel, um das Gehirn auf den Deckel der gläsernen Petrischale zu übertragen. Wenn Sie die andere Hälfte der zweischneidigen Rasierklinge zuvor beiseite gelegt haben, machen Sie zwei koronale Schnitte, um zuerst das Kleinhirn und dann den vordersten Teil des Gehirns, einschließlich der Riechkolben, zu entfernen (Abbildung 1).
- Tragen Sie Cyanacrylatkleber auf die Agarrampe auf. Legen Sie das Gehirn mit der großen Gewebezange ganz kurz auf ein Stück trockenes Filterpapier und übertragen Sie es dann sofort auf die Agarrampe, wobei Sie die ventrale Oberfläche des Gehirns auf den Klebstoff legen.
Anmerkung: Bei Schnitten des intermediären Hippocampus sollte das Gehirn so ausgerichtet werden, dass der vordere nach oben zur Neigung der Rampe zeigt und der hintere näher an der Klinge. Richten Sie bei Schnitten des ventralen Hippocampus das Gehirn so aus, dass das vordere Ende nach unten an der Neigung der Rampe zeigt, mit dem hinteren Ende am oberen Ende der Rampe, weiter von der Klinge entfernt. In jedem Fall sollte das Gehirn am oberen Ende der Rampe positioniert werden, so dass die koronal geschnittene Oberfläche des Gehirns mit dem Agar-Trägerblock in Kontakt kommt (Abbildung 1).
- Legen Sie die Schneideplattform mit dem Agar und dem Gehirn in die Schneidekammer des Mikrotoms und tauchen Sie sie vollständig in gekühlte Saccharoselösung ein. Mit dem großen Spatel/Löffel etwas Saccharose-Aufschlämmung in die Kammer geben, umrühren, um gefrorene Saccharose zu schmelzen und die Temperatur der Mischung schnell auf ~1–2 °C zu senken
Anmerkung: Beobachten Sie die Temperaturanzeige während des gesamten Schneidens. Wenn sich die Saccharoselösung auf über 3 °C erwärmt, mehr Gülle hinzufügen und mischen, um die Temperatur wieder zu senken.
- Schneiden Sie Scheiben mit einer Dicke von 450 μm mit einer Mikrotomgeschwindigkeit von 0,07 mm/s. Wenn jede Scheibe frei ist, verwenden Sie die kleine Gewebezange und ein scharfes Skalpell, um zuerst die beiden Hemisphären zu trennen und dann das Gewebe wegzuschneiden, bis die Scheibe hauptsächlich aus dem Hippocampus und den Parahippocampus-Regionen besteht (Abbildung 1).
- Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um die Scheiben einzeln in die Rückgewinnungskammer der Grenzfläche zu übertragen, und stellen Sie sicher, dass sie an der Grenzfläche zwischen ACSF und Luft positioniert sind und nur ein dünner Meniskus aus künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) die Scheiben bedeckt. Den Deckel der Kammer fest schließen und die Scheiben bei 32 °C 30 min ziehen lassen.
- Nach der anfänglichen Rückgewinnung bei 32 °C wird die Trennschicht-Rückgewinnungskammer aus dem Wasserbad genommen und auf ein Rührwerk gestellt, das auf eine langsame Geschwindigkeit eingestellt ist, damit der magnetische Rührstab die Zirkulation von ACSF in der Kammer fördert. Lassen Sie es allmählich auf Raumtemperatur abkühlen, während sich die Scheiben weitere 90 Minuten erholen. Stellen Sie sicher, dass die Rückgewinnungskammer ständig mit Karrenbogen gefüllt ist und lassen Sie keine großen Blasen unter den Scheiben eingeschlossen werden.
>3. Führen Sie lokale Feldpotentialaufzeichnungen (LFP) von spontaner Aktivität durch
- Bereiten Sie sich auf LFP-Aufnahmen vor, indem Sie alle erforderlichen Geräte einschalten, einschließlich des Computers, auf dem die Erfassungssoftware ausgeführt wird, des an den Computer angeschlossenen Monitors, der Stimulatoren, des Mikromanipulators, des Temperaturreglers, der Lichtquelle des Mikroskops, der am Mikroskop befestigten Kamera, des Mikroelektrodenverstärkers, des Digitalisierers und der Peristaltikpumpe. Wenn Sie ein zentrales Vakuumsystem verwenden, öffnen Sie das Wandventil, um die Vakuumleitung vorzubereiten, die ACSF aus der Aufnahmekammer entfernt.
- Füllen Sie den beheizten Behälter mit ACSF und stecken Sie dann ein Ende des Schlauchs in das 400-ml-Becherglas, in dem sich das sprudelnde ACSF befindet. Schalten Sie die Peristaltikpumpe ein, um den ACSF vom 400-ml-Becherglas zum beheizten Reservoir und vom Reservoir weiter zur Aufnahmekammer zu leiten. Klopfen oder kneifen Sie den Schlauch, um eingeschlossene Blasen zu lösen.
- Stellen Sie die Peristaltikpumpe so ein, dass die ACSF-Durchflussrate durch die Aufnahmekammer schnell ist (~ 8–10 mL/min). Stellen Sie mit einem Temperaturfühler sicher, dass sich der ACSF in der Mitte der Aufnahmekammer auf 32 °C befindet.
Anmerkung: Wenn ACSF mit einer Schlauchpumpe in die Aufzeichnungskammer abgegeben wird, kann eine hohe Durchflussrate zu einer erheblichen Schwankung der Durchflussrate führen. Gleichmäßige Durchflussraten können mit einem einfachen Pulsationsdämpfer erreicht werden, der aus einer Reihe von leeren Spritzen besteht, die in den Schlauch integriert sind (Abbildung 2).
- Bereiten Sie Stimulations- und Aufnahmepipetten aus Borosilikatglaskapillaren mit einem beheizten Filamentabzieher vor. Das Puller-Protokoll sollte so konfiguriert werden, dass es Pipetten mit einem Widerstand von 2–3 MOhm für die Stimulation oder lokale Feldpotential-Aufzeichnungselektroden liefert.
- Befüllen Sie Stimulationspipetten mit 1 M NaCl und LFP-Pipetten mit ACSF.
- Klemmen Sie den Schlauch kurz ein und schalten Sie die Pumpe aus, um den ACSF-Durchfluss zu unterbrechen. Übertragen Sie eine Scheibe mit einer feinen Pinzette in die Aufnahmekammer, um eine Ecke des Linsenpapiers zu greifen, auf der die Scheibe ruht – die Scheibe bleibt am Linsenpapier haften. Legen Sie das Linsenpapier und die Scheibe mit der Scheibe nach unten in die Aufnahmekammer und ziehen Sie dann das Linsenpapier ab, so dass die Scheibe in der Aufnahmekammer versinkt. Sichern Sie die Scheibe mit einer Harfe.
Anmerkung: Harfen können vorgefertigt oder im Labor aus einem U-förmigen Stück Edelstahl oder Platin und feinem Nylonfilament hergestellt werden.
- Legen Sie eine mit NaCl gefüllte Stimulationspipette in den manuellen Mikromanipulator und schieben Sie die Spitze der Pipette langsam in einem Winkel von ca. 30–45° in die Oberfläche der Scheibe (z. B. in die Stratum radiatum-Schicht). Sobald die Spitze der Pipette in das Gewebe eindringt, schieben Sie die Pipette langsam nach vorne und unterlassen Sie große Bewegungen in lateraler oder vertikaler Richtung, die Axone innerhalb der Scheibe unnötig beschädigen könnten. Platzieren Sie die Spitze der Pipette mindestens 50–100 μm tief in der Schnitte, um oberflächennahe Zellen zu vermeiden, die beim Schneiden beschädigt wurden.
- Setzen Sie eine mit ACSF gefüllte LFP-Pipette in den Pipettenhalter ein, der am motorisierten Mikromanipulator angebracht ist. Üben Sie einen sehr leichten Überdruck aus, indem Sie entweder Munddruck oder eine 1-ml-Spritze verwenden, die über ein Absperrhahnventil und ein kurzes Schlauchstück mit dem Pipettenhalter verbunden ist.
Anmerkung: Positionieren Sie die LFP-Pipetten innerhalb der Schnitte, um die interessierenden Signale aufzuzeichnen: Bei scharfen Wellenwellen sollte eine LFP-Pipette in das Stratum pyramidale (SP) und eine zweite Pipette in das Stratum radiatum (SR) eingesetzt werden. Diese Konfiguration ermöglicht die gleichzeitige Aufzeichnung der negativen Sharp-Welle im SR und der hochfrequenten Welligkeitsschwingung im SP (Abbildung 3).
- Schieben Sie mit dem Mikromanipulator die Spitze der LFP-Pipette langsam in einem Winkel von etwa 30–45° in den interessierenden Bereich (z. B. die CA1-Pyramidenzellschicht) vor. Platzieren Sie die Spitze der Pipette mindestens 50–100 μm tief in der Schnitte, um oberflächennahe Zellen zu vermeiden, die beim Schneiden beschädigt wurden. Während Sie die LFP-Pipette vorschieben, geben Sie mit der Erfassungssoftware kontinuierlich einen kleinen Spannungsprüfimpuls ab und achten Sie auf einen plötzlichen Anstieg des Elektrodenwiderstands. Dies kann darauf hindeuten, dass die Pipette verstopft oder gegen eine Zelle gedrückt wurde.
- Sobald sich die LFP-Pipette im interessierenden Bereich positioniert hat, lassen Sie den Überdruck vorsichtig ab, indem Sie das Ventil an dem Schlauch öffnen, der an der Pipettenhalterung befestigt ist.
- Um den LFP gleichzeitig an einer zweiten Stelle aufzuzeichnen, wiederholen Sie die Schritte 6.8 bis 6.10 mit einer zweiten Pipette und einem Mikromanipulator.
- Verwenden Sie den Mikroelektrodenverstärker in der Stromzangenkonfiguration, um die spontane Aktivität im lokalen Feldpotential aufzuzeichnen, nachdem Sie die Brückenausgleichsfunktion in der Erfassungssoftware verwendet haben, um den Serienwiderstand der Pipette zu korrigieren. Spontane Sharp-Wave-Ripples (SWRs) erscheinen als positive Ablenkungen im extrazellulären Potential der SP-Schicht (Abbildung 3).
- Um evozierte Feldpotentiale aufzuzeichnen, verwenden Sie die an den Digitizer angeschlossenen Stimulatoren, um einen kurzen (200 us) Rechteckspannungsimpuls durch die mit NaCl gefüllte Stimulationspipette abzugeben. Stellen Sie den Stimulationsspannungsregler ein, um einen Bereich von Reaktionsamplituden hervorzurufen.
