Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Aufbau elektrophysiologischer Aufzeichnungen
- Stecken Sie die Haut des Außenohrs der Maus (Ohrmuschel) mit feinen Insektenstiften an den Rändern (~6-8 pro Ohr) an die PDMS-ausgekleidete Basis einer Aufnahmekammer und platzieren Sie die gereinigten Nerven an der Basis des Ohrs in der Nähe von zwei Saugelektroden – eine für die Aufnahme (um den Nerv zu nehmen) und die andere eine indifferente Elektrode (um das neutrale Signal an einen Differenzverstärker zu liefern).
- Für die Aufzeichnungselektrode passen Sie die Öffnung und den Innendurchmesser der Öffnung sorgfältig an die kombinierte Dicke der beiden Nerven an, so dass sie so eng wie möglich und für eine möglichst große Länge passen.
- Ziehen Sie die Nerven durch sanftes Saugen aus einer 2-ml-Spritze, die am anderen Ende mit einem Silikongummischlauch befestigt ist, in die Elektrode. Stellen Sie sicher, dass die Nerven gerade und nicht gefaltet oder gedoppelt sind.
- Entwickeln Sie eine Passung mit hohem elektrischem Widerstand/Impedanz, indem Sie mit stärkerem Sog Bindegewebe oder Fettgewebe zu einem Pfropfen ziehen, der die Öffnung um den Nerv herum fest abdichtet.
- Füllen Sie die andere (indifferente) Elektrode bei Bedarf durch Absaugen mit Kochsalzlösung (sie kann durch Kapillarwirkung gefüllt werden).
- Legen Sie identische Aufzeichnungsdrähte (Silber oder Platin) in die innere Bohrung der Aufzeichnungselektroden, um die Kochsalzlösung und den Nerv zu berühren (Aufzeichnung) oder verengtes, feuerpoliertes Ende (indifferent) der Elektrode. Jede Elektrode wird einzeln auf verschiedene Adern aus zweiadrigen, geschirmten Kabeln gelötet. Legen Sie die Badelektrode (Ag/AgCl-Pellet) in das Bad und erden Sie sie am Schirm des zweiadrigen Kabels, das mit den Aufnahmeelektroden verbunden ist.
- Die elektrische Aktivität der beiden Elektroden wird in die separaten Kanäle eines Differenzverstärkers geleitet, gefiltert (Banddurchgang 0,2-2 kHz) und auf einem Oszilloskopbildschirm angezeigt. Vergewissern Sie sich, dass der elektrische Rauschpegel von Kanal A (Aufnahme) und Kanal B (indifferent) ähnlich aussieht. Zu diesem Zeitpunkt ist es möglicherweise nicht möglich, die normalen spontanen Aktionspotentiale in Kanal A zu sehen, bevor die beiden Elektroden ausgeglichen sind.
- Unterschiede im Hintergrundrauschen zwischen den Elektroden werden durch Erhöhung der Impedanz der Aufzeichnungselektroden (Kanal A) oder der indifferenten Elektroden (Kanal B) ausgeglichen. Tun Sie dies, indem Sie areoläres (Fettgewebe) Bindegewebe weiter in eine der Elektroden saugen und/oder eine größere Saugkraft auf die 50-ml-Spritze ausüben.
- Sobald Sie auf diese Weise "ausgeglichen" sind, schalten Sie zurück zur differentiellen (A-B) Aufzeichnung und suchen Sie nach spontanen Aktionspotentialen (APs) in der Spur oder beim Streicheln von Haaren am Rand der Ohrmuschel. Wenn keine Aktivität (Spiking) zu sehen ist, überprüfen Sie erneut den festen Sitz des Nervs in der Aufzeichnungselektrode und des areolären Bindegewebes in der indifferenten Elektrode – in der Regel gilt: Je fester (höherer Widerstand) die Abdichtung und je gleichmäßiger die Impedanz in den beiden Elektroden, desto besser. Mit der Praxis wird so ein Signal-Rausch-Verhältnis von guter Qualität (>2:1) erreicht.
- Zeichnen Sie das Elektroneurogramm über eine Laborschnittstelle und eine Elektrophysiologie-Software auf, die auf einem Computer läuft. Eine Audioausgabe von Spiking ist sehr nützlich und kann erreicht werden, indem das Neurogramm durch einen Audioverstärker und den zugehörigen Audiolautsprecher geleitet wird. Stellen Sie den Schwellenwert so ein, dass er knapp über dem Grundlinienrauschen liegt (erkennbar an der Abwesenheit von weißem Rauschen).
- Um den Zugang von Arzneimitteln oder fluoreszierenden Styrylfarbstoffen zu den lanzettlichen Enden zu verbessern, schälen Sie die subdermale Fettschicht in der Nähe des Ohrmuschelrandes vorsichtig ab und öffnen Sie ein Fenster von ~5 mm x 5 mm, wodurch die Dermis und die Basis der Follikel freigelegt werden (Abbildung 1A, B).
- Stecken Sie eine Falte von ~1 mm fettfreigewaschener Ohrhaut am vorderen Rand (ggf. auf Höhe des gerade produzierten Fensters) zurück und lassen Sie einen klaren, mit Kochsalzlösung gefüllten Spalt zwischen den applizierten Hautschichten. Streichen Sie vorsichtig mit einer Nadel oder einer geerdeten feinen Pinzette über die Haare, die entlang der gefalteten Kante hervorstehen, ohne die Haut zu berühren, um den Bereich der maximalen AP-Ausgabe auf dem Oszilloskop und die charakteristischen "Klicks" und "Pops" in der Audioausgabe zu lokalisieren.
>2. Aufzeichnung von reizevozierten Aktionspotentialen
- Positionieren Sie die mechanische Stimulationssonde – ein feuerpoliertes 10 cm großes Borosilikat-Mikroelektrodenglas, das an einem piezoelektrischen Keramikaktor befestigt ist – so, dass die Bewegung parallel zur Hautfalte verläuft. Platzieren Sie die Spitze etwa 0,5-1 mm von der Hautfalte entfernt, so dass sie die Haare, aber nicht die Haut berührt. Überprüfen Sie die effektive Stimulation, indem Sie die Sondenspitze langsam manuell bewegen, um die Haare abzulenken und das Stacheln zu beobachten/zu hören.
- Verwenden Sie die Software, um die mechanische Stimulation von 1-3 Haaren zu steuern (z. B. 3 Sekunden bei 5 Hz Sinuskurven, alle 10 Sekunden, Sondenverschiebung 200-500 μm) und zeichnen Sie die durch die Stimulation hervorgerufenen Reaktionen in den Nerven auf.
- Geben Sie mehrere identische mechanische Stimulationszüge im Abstand von 10 Sekunden. Optimieren Sie die Sondenposition für Wiederholbarkeit und reduzieren Sie dann die Stimulationshäufigkeit gemäß dem Versuchsprotokoll (z. B. Tropfenwiederholrate von 10 Sekunden auf 30 Sekunden).
- Verwenden Sie die Software, um AP-ähnliche Aktivitäten zu unterscheiden, z. B. mit einem einfachen Schwellenwert, der auf das ~2-fache der hochfrequenten Rauschamplitude und ~25 % der größten APs eingestellt ist.
- Zählen Sie die APs, die den Schwellenwert überschreiten, als "Ereignisse" und quantifizieren Sie die Häufigkeit und die Merkmale der erzeugten APs.
>3. Aufnahme von Stimulus-evoziertem Feuern in Kombination mit N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)-pyridiniumdibromid-Markierung
- Um die Auswirkungen von Styrylfarbstoffen auf das reizevozierte afferente Brennen und die terminale Markierung zu untersuchen, geben Sie die entsprechende Konzentration eines Styrylfarbstoffs Ihrer Wahl in die Badelösung und fahren Sie mit der elektrischen Aufzeichnung fort.
- Bereiten Sie nach der erforderlichen Einwirkzeit (in der Regel mindestens 30 Minuten) das Präparat für die Betrachtung der Follikel vor. Klappen Sie den Hautlappen auf, indem Sie die Haltestifte entfernen, und legen Sie den freigelegten Hautbereich frei, um die Endbeschriftung freizulegen.
- Waschen Sie den äußeren Farbstoff mit farbstofffreier Kochsalzlösung ab und wechseln Sie die Kochsalzlösung 3 Mal vollständig.
- Inkubieren Sie 10-15 Minuten lang im letzten Wechsel von gasförmiger, farbstofffreier Kochsalzlösung, damit die hartnäckigste Farbstoffkontamination aus exponierten/externen Membranen auslaugen kann.
- Nicht internalisierter Farbstoff, der auf den Membranen verbleibt, wird mit einem Sequestrierungsmittel (Sulfobutyliertes Beta-Cyclodextrin, 1 mM, 5 min) in Kochsalzlösung entfernt.
- Übertragen Sie die Aufnahmekammer auf den Tisch eines aufrechten Epifluoreszenzmikroskops und aktivieren Sie die Kammer mit dem Tisch-/Objektträgerbewegungsmechanismus.
- Beleuchten Sie das Präparat mit Anregungslicht, das für den Styrylfarbstoff geeignet ist. Verwenden Sie ein 10-faches oder 25-faches Fluoreszenzmikroskopobjektiv, um die Follikelmarkierung zu beobachten (Abbildung 1).
