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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung von Elektroden und Kabeln für EEG/EMG-Aufzeichnungen
- Bereiten Sie die EEG/EMG-Aufzeichnungselektrode gemäß dem folgenden Verfahren vor.
Anmerkung: Die Elektrode ist Einweg und kann nur für 1 Tier verwendet werden. Planen Sie die Verdrahtungskonfiguration für alle Steckverbinder sorgfältig. Markieren Sie die Verbinder für die richtige Ausrichtung.
- Löten Sie jeden Stift einer 4-poligen Stiftleiste an einen 2 cm langen Edelstahldraht. Kurz gesagt, halten Sie ein Ende des Drahtes an den Stift, legen Sie einen heißen Lötkolben auf die Draht-Stift-Verbindung und schmelzen Sie etwas Lötmittel, um sicherzustellen, dass gerade genug Lot gleichmäßig in die Verbindung läuft. Achten Sie darauf, dass Sie nicht zu viel Hitze auf den Stift ausüben. Andernfalls schmilzt der Kunststoff um die Stifte.
- Löten Sie das freie Ende von je 2 Drähten, die an der Stiftleiste befestigt sind, an den Kopf einer Edelstahlschraube mit einem Durchmesser von 1,0 mm. Kurz gesagt, halten Sie das freie Ende des Drahtes an das Gewinde unterhalb des Schraubenkopfes, legen Sie einen heißen Lötkolben auf die Draht-Schrauben-Verbindung und schmelzen Sie etwas Lötmittel, um sicherzustellen, dass gerade genug Lot gleichmäßig in die Verbindung läuft. Die 2 Drähte mit Schrauben dienen als EEG-Aufzeichnungselektroden, während die 2 Drähte ohne Schrauben als EMG-Aufzeichnungselektroden dienen.
- Entfernen Sie mit einer Schere 1 mm der Isolierung am Ende der EMG-Elektroden, um die Qualität des EMG-Signals zu erhöhen.
- Decken Sie alle gelöteten Stifte vollständig mit Epoxidkleber ab, indem Sie einen dünnen Holzstab oder Zahnstocher verwenden, um das elektrische Rauschen bei EEG/EMG-Aufzeichnungen zu reduzieren.
- Bereiten Sie ein Kabel für die Verbindung der Elektrode mit dem Schleifring vor, wie unten beschrieben. Dieses Kabel kann wiederverwendet werden.
- Löten Sie jeden Pin eines 4-poligen FFC/FPC-Steckers mit einem Draht eines 30 cm langen Flachbandkabels. Kurz gesagt, halten Sie das abisolierte Ende des Drahtes an den Stift, legen Sie einen heißen Lötkolben auf die Draht-Stift-Verbindung und schmelzen Sie etwas Lot, um sicherzustellen, dass gerade genug Lot reibungslos in die Verbindung läuft.
Hinweis: Wählen Sie die Länge des Flachbandkabels, die für die Höhe des Versuchstierkäfigs geeignet ist, der für EEG/EMG-Aufzeichnungen verwendet wird.
- Löten Sie die Crimpbuchsen an eine Spitze der Drähte am anderen Ende des Flachbandkabels. Kurz gesagt, halten Sie eine Crimpbuchse an das abisolierte freie Ende des Drahtes, legen Sie einen heißen Lötkolben auf die Draht-Buchse-Verbindung und schmelzen Sie etwas Lötmittel, um sicherzustellen, dass gerade genug Lot reibungslos in die Verbindung läuft.
- Stecken Sie jede Crimpbuchse in ein 4-poliges Crimpgehäuse.
- Decken Sie die Crimpmuffen mit einem dünnen Holzstäbchen oder Zahnstocher vollständig mit Epoxidkleber ab.
>2. Implantation von Elektroden in den Mauskopf (Dauer: ca. 20 min)
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Operation in einem Heißperlensterilisator. Betäuben Sie eine männliche Maus (10 - 20 Wochen alt, 20 - 30 g) mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (50 mg/kg). Nachdem Sie überprüft haben, ob die Maus durch Einklemmen eines Zehs tief betäubt ist, rasieren Sie die Haare an Kopf und Hals mit einer Haarschneidemaschine.
- Bewegen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen und fixieren Sie den Kopf zwischen den 2 Ohrstangen. Tragen Sie Vaseline auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern. Reinigen Sie die rasierte Haut mit Alkohol und schneiden Sie sie mit einem Skalpell entlang der Mittellinie, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie die Haut ab, um den Operationsbereich offen zu halten.
- Mit einem Hartmetallfräser (Bohrergröße: 0,8 mm Durchmesser) bohren Sie 2 Löcher in den Schädel, eines über den frontalen kortikalen Bereich (1 mm anterior zum Bregma, 1,5 mm lateral zur Mittellinie) und das andere über den parietalen Bereich (1 mm anterior zum Lambda, 1,5 mm lateral zur Mittellinie) der rechten Hemisphäre, entsprechend den stereotaktischen Koordinaten von Paxinos und Franklin.
- Setzen Sie mit einem Juwelierschraubendreher EEG-Aufzeichnungsschrauben aus Edelstahl in die Löcher und machen Sie 2 - 2,5 Umdrehungen für jede Schraube für die epidurale Positionierung über der Rinde.
Hinweis: Setzen Sie die Schrauben nicht zu tief ein, um eine Schädigung des Hirngewebes zu vermeiden. Überprüfen Sie, ob die Schrauben fest am Schädel befestigt sind. Dies ist wichtig, um über einen langen Zeitraum mehrerer Aufzeichnungen (in der Regel mehr als 1 Monat) stabile EEG-Signale zu haben. Wackelige Schrauben erzeugen EEG-Artefakte und können sich vor dem Ende des Versuchsplans lösen.
- Befestigen Sie die Elektrodeneinheit (vgl. Abschnitt 1.1, Stifte nach oben gedreht) mit Sekundenkleber am Schädel und bedecken Sie sie mit Zahnzement. Machen Sie beidseitig kleine Löcher mit einer Pinzette in die Trapezmuskeln und führen Sie die Edelstahldrähte, die als EMG-Elektroden dienen, in die Löcher ein. Nähen Sie die Haut mit einem Seidenfaden (0,1 mm Durchmesser), um eine Freilegung des Muskels zu vermeiden.
- Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Rahmen. Verabreichen Sie der Maus intraperitoneal Ampicillin (100 mg/kg) und Meloxicam (1 mg/kg), um eine bakterielle Infektion zu vermeiden bzw. postoperative Schmerzen zu lindern. Halten Sie die Maus auf einem Heizkissen und überwachen Sie sie, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten. Halten Sie die Maus während der Genesung einzeln, um eine Entfernung der Elektroden durch andere Tiere zu vermeiden, und verabreichen Sie Meloxicam (1 mg/kg) intraperitoneal am ersten Tag nach der Operation.
>3. Aufzeichnen und Erfassen von EEG/EMG-Daten
- Nach einer 1-wöchigen Erholungsphase wird jede Maus einzeln in einem experimentellen Käfig untergebracht, der in einer schalldichten Aufnahmekammer platziert ist. Halten Sie eine Umgebungstemperatur von 23 ± 1 °C aufrecht und steuern Sie automatisch die Zyklen von 12 Stunden Licht / 12 Stunden Dunkelheit (leuchtet um 08:00 Uhr, Beleuchtungsstärke ~ 100 Lux).
- Verbinden Sie die EEG/EMG-Elektrodeneinheit am Mauskopf mit einem Aufnahmekabel. Stellen Sie sicher, dass das Aufnahmekabel mit einem Schleifring (der so konstruiert ist, dass die Bewegungen der Maus nicht durch Verdrehen des Kabels eingeschränkt werden) und einem EEG/EMG-Signalverstärker verbunden ist. Filterung von EEG/EMG-Signalen (EEG, 0,5-64 Hz; EMG, 16-64 Hz), digitalisieren mit einer Abtastrate von 128 Hz durch einen Analog-Digital-Wandler (A/D) und zeichnen schließlich auf einem Computer auf, auf dem eine EEG/EMG-Aufzeichnungssoftware ausgeführt wird.
- Gewöhnen Sie die Maus für 2 - 3 Tage in der Aufnahmekammer.
- Starten Sie anschließend die EEG/EMG-Aufzeichnungssoftware.
- Wählen Sie die Registerkarte "Informationen zur Datendatei" und klicken Sie auf das Kästchen neben dem Dateinamen. Geben Sie einen Dateinamen ein und klicken Sie auf "Speichern".
- Wählen Sie die Registerkarte "Aufnahmebedingung" und wählen Sie alle EEG/EMG-Kanäle aus, die aufgezeichnet werden sollen.
- Wählen Sie die Abtastfrequenz (128 Hz) auf der Registerkarte "Aufnahmebedingung" aus.
- Überprüfen Sie, ob die ausgewählten Kanäle auf der Registerkarte "Kanalinformationen" korrekt angezeigt werden.
- Wählen Sie die Registerkarte "Timer-Einstellung" und klicken Sie auf "Monitor", um EEG und EMG anzuzeigen.
- Prüfen Sie, ob EEG/EMG-Signale korrekt angezeigt werden.
- Wählen Sie den Reiter "Timer-Einstellung" und stellen Sie im Bereich "Haupt-Timer" die Uhrzeit für den Beginn und das Ende der Aufnahme ein.
- Klicken Sie auf der Registerkarte "Timer-Einstellung" auf "Monitor", um die Aufnahme zu starten.
- Aufzeichnung von EEG/EMG-Signalen zu Studienbeginn (d. h. Schlaf-/Wachverhalten einer sich frei verhaltenden Maus). Euthanasieren Sie die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (200 mg/kg) nach dem letzten Versuchstag.