$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Präparieren und Vorbereiten der Larve Drosophila ZNS
HINWEIS: Methoden zur ZNS-Dissektion von Larven sind in Hafer und Schedl deutlich dargestellt, aber diese zuvor veröffentlichten Methoden reduzieren die Länge der absteigenden Neuronen, die für die Messung der Spike-Frequenz wichtig sind. Hier wird eine zusätzliche Methode zur Entfernung des larvalen ZNS skizziert, die lange, intakte absteigende Neuronen erhält.
- Zubereitung von Kochsalzlösung.
- Bereiten Sie die Dissektion und die Aufnahme von Kochsalzlösung auf Folgendes in mM vor: 157 NaCl, 3 KCl, 2 CaCl2, 4 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethansulfonsäure (HEPES); titrieren Sie den pH-Wert auf 7,25.
- Präparieren Sie die Larve Drosophila ZNS.
- Identifizieren und extrahieren Sie einen wandernden Drosophila melanogaster im dritten Stadium aus dem Kulturfläschchen und geben Sie ihn in 200 μl Kochsalzlösung (Abbildung 1A).
- Fassen Sie die Mundhaken mit einer feinen Pinzette und fassen Sie mit einer zweiten Pinzette den Bauch der Made (Abbildung 1B) (Abbildung 1B).
Anmerkung: Üben Sie nicht zu viel Druck auf den Bauch aus, da dies zum Einreißen der dünnen Kutikularschicht der Made führen kann.
- Ziehen Sie die Mundhaken und den Bauch vorsichtig in verschiedene Richtungen, um das kaudale Ende der Made von der Kopfregion zu trennen und die Eingeweide der Made freizulegen (Abbildung 1C).
Anmerkung: Das ZNS ist mit der Luftröhre und dem Verdauungstrakt verflochten. Schneiden Sie das ZNS nicht von jeglichem Gewebe weg, um zu verhindern, dass die absteigenden peripheren Nerven durchtrennt werden.
- Ziehen Sie das ZNS mit einer Zange aus dem Verdauungstrakt und der Luftröhre heraus (Abbildung 1D).
- Falls erforderlich, die Blut-Hirn-Schranke unterbrechen, indem das ZNS hinter den Hirnlappen manuell mit einer Federschere von Vannas durchtrennt wird.
Anmerkung: Dies sollte auf der Grundlage der physikalisch-chemischen Eigenschaften der verwendeten Chemikalie erfolgen. Die rote Linie in Abbildung 2A ist der vorgeschlagene Durchtrennungspunkt und das durchtrennte ZNS mit intakten absteigenden peripheren Nervenstämmen, die in Abbildung 2B gezeigt sind. Das durchtrennte ZNS ist nach Abschluss von Schritt 1.2.5 bereit für die Experimente.
>2. Extrazelluläre Aufzeichnung von Drosophila ZNS.
- Bereiten Sie das ZNS für die Aufzeichnung vor.
- Ziehen Sie eine Glaspipettenelektrode aus Borosilikatglaskapillaren auf einen Widerstand von 5-15 mΩ.
- Führen Sie das durchtrennte ZNS in die Wachskammer ein, die 200 μl Kochsalzlösung enthält. Klemmen Sie einen unbeschichteten Insektenstift mit der Krokodilklemme, die mit dem Erdungskabel verlötet ist, und stecken Sie den Stift in die Kochsalzlösung, um den Stromkreis zu vervollständigen.
- Richten Sie die Elektrode mit den Mikromanipulatoren auf das kaudale Ende des durchtrennten ZNS aus. Eliminieren Sie die Aufzeichnung von Hintergrundgeräuschen, indem Sie den Schwellenwert in der Erfassungs-/Analysesoftware anpassen, bevor Sie mit den peripheren Nervenstämmen in Kontakt kommen.
- Ziehen Sie alle geeigneten peripheren Nerven in die Saugelektrode, indem Sie leichten Unterdruck auf die Spritze ausüben.
Anmerkung: Die Ausgangszündfrequenz korreliert mit der Anzahl der Neuronen, die in die Elektrode gezogen werden, wobei mehr Neuronen oft zu einem erhöhten Widerstand der Elektrode führen.
- Beginnen Sie mit der extrazellulären Aufzeichnung der absteigenden Nervenaktivität des ZNS.
- Starten Sie die Aufzeichnung in der Datenerfassungssoftware und überwachen Sie die Grundzündfrequenz. Lassen Sie die Zündrate 5 Minuten lang ausgleichen, bevor Sie Daten zur Basiszündrate sammeln.
- Die Vorbereitung und Aufzeichnung ist zu verwerfen, wenn das Brandmuster der Kontrollbehandlung nicht ähnlich dem in Abbildung 3A gezeigten Berstmuster ist.
Anmerkung: Ein verändertes Feuermuster deutet auf eine abnormale oder instabile Aktivität des zentralen Mustergenerators hin, die die neuronale Funktion verändern kann.
- Fügen Sie nach 5 Minuten 200 μl Kochsalzlösung + Vehikel hinzu, um das Gesamtvolumen der Kammer auf 400 μl zu bringen und mit der Aufzeichnung der Kontrollfeuerraten zu beginnen.
- Nachdem der Ausgangswert festgelegt wurde (3-5 min), entnehmen Sie 200 μl Kochsalzlösung und fügen Sie 200 μl des in Kochsalzlösung solubilisierten Versuchsmittels hinzu.
Anmerkung: Dimethylsulfoxid (DMSO) ist das empfohlene Lösungsmittel für lipophile Verbindungen und sollte 0,1 Vol.-% nicht überschreiten.
- Wenden Sie Arzneimittelkonzentrationen seriell an (niedrige bis hohe Konzentrationen) und zeichnen Sie jede Konzentration für einen ausgewählten Zeitraum auf (vom Prüfarzt auf der Grundlage der chemischen Eigenschaften des Arzneimittels bestimmt). Kennzeichnen Sie diesen Zeitpunkt der Arzneimittelanwendung in der Erfassungs-/Analysesoftware, indem Sie einen Kommentar einfügen, der das Arzneimittel und die Endkonzentration enthält.
Anmerkung: Die Brennaktivität des ZNS nimmt nach 30-50 Minuten nach der Dissektion um etwa 10-20% ab, und daher sollten geeignete unbehandelte Kontrollen durchgeführt werden, und die medikamentöse Behandlung sollte diesen Zeitraum nicht überschreiten.
