Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Vorbereitung des MEA-Setups
Hinweis: Beginnen Sie 15 Minuten vor der Aufnahme.
- Das verbleibende Volumen von 4AP-ACSF (4-Aminopyridin künstliches Liquor) wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben überführt.
- Stellen Sie den Erlenmeyerkolben auf ein Regal über dem MEA-Verstärker (Mikroelektrodenarrays) und verwenden Sie einen Schlauch, damit die Lösung kontinuierlich eine 60-ml-Spritze zuführen kann. Die Höhe des Erlenmeyerkolbens und der Spritze ist so einzustellen, dass eine Schwerkraftrate von 1 ml/min.
Anmerkung: Die richtige Höhe hängt vom Innendurchmesser (ID) des Schlauches ab. Für Schläuche mit einem Innendurchmesser von 5/32 Zoll sind 30 cm ausreichend.
- Beginnen Sie mit dem Blubbern des 4AP-ACSF im Erlenmeyerkolben und in der Spritze mit einem 95%igen O2/5% CO2 -Gasgemisch
.
- Lassen Sie das 4AP-ACSF durch den Perfusionsschlauch in ein Becherglas fließen, bis sich keine Luft mehr im Inneren befindet, und stoppen Sie dann den Lösungsfluss.
- Verbinden Sie das Heizelement an der MEA-Basis mit dem Thermostat. Setzen Sie den trockenen MEA-Chip in den MEA-Verstärker ein und befestigen Sie den Verstärkerkopf. Eine Pasteurpipette aus Kunststoff überträgt 4AP-ACSF in den Einlass und das äußere Reservoir der Aufnahmekammer.
- Befestigen Sie die Heizkanüle an einer Magnethalterung und platzieren Sie die Spitze in der Einlassöffnung der Aufnahmekammer. Befestigen Sie die Magnethalterung an einem Magnetstreifen am MEA-Verstärkerkopf. Verbinden Sie den Perfusionsschlauch mit der Kanüle. Verbinden Sie die Kanüle mit dem Thermostat.
Anmerkung: Die Heizkanüle sollte mit einem abgeschrägten Schlauch aus Polytetrafluorethylen (PTFE) bedeckt sein, um die Einlassöffnung der Aufnahmekammer zu erreichen und die Geräuschentwicklung aufgrund des metallischen Materials zu minimieren. Wenn das Einlassreservoir ausreichend mit 4AP-ACSF gefüllt ist, sollten Tropfen, die aus dem Perfusionssystem fallen, nicht sichtbar sein.
- Setzen Sie die Saugnadel in den Behälter ein und überprüfen Sie, ob ein Unterdruck vorhanden ist, indem Sie sie in den ACSF eintauchen. Prüfen Sie, ob ein konstantes niederfrequentes Sauggeräusch zu hören ist.
Anmerkung: Die Saugnadel sollte so platziert werden, dass der 4AP-ACSF knapp über der Oberfläche der Hirnschnitte fließt. Es kann eine Vakuumleitung oder eine geräuscharme Vakuumpumpe verwendet werden.
- Stellen Sie den Durchflussregler so ein, dass er eine Durchflussrate von 1 ml/min zulässt, und beginnen Sie mit der Perfusionierung.
Anmerkung: Die Schwerkraftperfusion eliminiert das Geräusch, das durch Schlauchpumpen verursacht werden kann. Wenn Schlauchpumpen bevorzugt werden, sind geräuscharme Modelle obligatorisch.
- Sobald 4AP-ACSF durch die Kanüle fließt, schalten Sie den Thermostat ein. Stellen Sie die Heizkanüle auf 37 °C und die MEA-Basis auf 32 °C ein, um eine Temperatur von 32 - 34 °C in der Aufnahmekammer zu erreichen.
HINWEIS: VORSICHT! Erhitzen Sie die Kanüle niemals ohne Lösung, da sie sonst irreversibel beschädigt werden kann. Stellen Sie die Temperatur der Kanüle höher als die Aufnahmetemperatur ein (d. h. 32 - 34 °C), um den Eigentemperaturversatz zwischen dem eingestellten Wert und dem tatsächlichen Wert an der Spitze der Heizkanüle und innerhalb der Aufnahmekammer zu berücksichtigen. Die Durchflussrate, die Umgebungstemperatur und das Volumen der Aufnahmekammer beeinflussen die Temperatur der Aufnahmelösung. Die in Schritt 1.9 gemeldeten Einstellungen sind für das beschriebene Protokoll und die beschriebene Ausrüstung optimiert. Überprüfen Sie immer die tatsächliche Aufnahmetemperatur mit einem Thermoelement und passen Sie die Einstellungen nach Bedarf an. Erhitzen Sie die MEA-Basis nicht über 34 °C, um eine Überhitzung der Hirnscheibe zu vermeiden.
- Setzen Sie die externe Referenzelektrode in das Einlassreservoir der Aufnahmekammer ein.
Anmerkung: Obwohl MEA-Chips mit einer internen Referenzelektrode ausgestattet sind, deckt die kundenspezifische Aufnahmekammer diese ab. Daher muss eine externe Referenzelektrode verwendet werden. Ein gesättigtes KCl-Pellet (Kaliumchlorid) ist am praktischsten, da es ohne Chlorierung gebrauchsfertig ist.
>2. MEA Live-Kartierung
- Sobald der 4AP-ACSF-Pegel und die Aufnahmetemperatur wie gewünscht stabilisiert sind, drehen Sie die Perfusion und die Saughähne in die Aus-Position, um sie vorübergehend zu stoppen.
- Übertragen Sie schnell ein Hirnschnitt mit einer Pasteur-Pipette aus umgekehrtem Glas in die MEA-Aufnahmekammer. Passen Sie die Position auf dem MEA-Aufnahmebereich nach Bedarf mit einer feuerpolierten, gekräuselten Pasteur-Pipette (Abbildung 1C) oder einer weichen, kompakten Bürste an. Platzieren Sie den Niederhalteanker (Abbildung 1D) auf der Hirnscheibe. Starten Sie die Perfusion und die Absaugung neu, indem Sie die Absperrhähne wieder in die Ein-Position drehen.
HINWEIS: KRITISCH! Die Scheibe sollte übertragen werden, und die Perfusion sollte innerhalb von 60 s wieder aufgenommen werden, sonst könnte das Gewebe absterben. Der Scheibenhalteanker sollte in 4AP-ACSF gehalten werden, um zu verhindern, dass sich der Hirnschnitt beim Platzieren des Ankers auf dem Hirnschnitt aufgrund von Unterschieden in der oberflächlichen Spannung bewegt. Der Anker zur Befestigung des Hirnschnitts an der MEA kann aus Edelstahldraht und Nylonfaden (Abbildung 1D) nach Maß angefertigt oder aus kommerziellen Quellen bezogen werden. Abbildung 1E zeigt den endgültigen Versuchsaufbau, bei dem der MEA-Chip mit dem Kopf des Verstärkers verbunden ist: Eine Gehirnscheibe, die auf dem MEA-Chip in der Aufnahmekammer ruht, wird von dem benutzerdefinierten Anker festgehalten. Die Referenzelektrode (roter Kreis) und der PTFE-Schlauch, der die Heizkanüle abdeckt (roter Pfeil), befinden sich im Einlaufbehälter, während die Saugnadel (blauer Pfeil) im Auslassbehälter positioniert ist.
- Machen Sie ein Foto des Gehirnschnitts mit einer Kamera, die auf einem inversen Mikroskoptisch montiert ist.
- Führen Sie das Skript mapMEA auf der Computersoftware aus, um die GUI zum Mappen der Elektroden zu starten.
Anmerkung: Die maßgeschneiderte Software ermöglicht es dem Benutzer, die Elektroden auszuwählen, die bestimmten Strukturen des Hirnschnitts entsprechen. Dieser Schritt ist entscheidend, um den richtigen Signalweg zu aktivieren und die iktale Aktivität durch elektrische Stimulation zu unterdrücken.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Durchsuchen, um das Bild des Gehirnschnitts zu laden. Stellen Sie sicher, dass die Referenzelektrode in der oberen Reihe der linken Hälfte der MEA erscheint (Abbildung 2A, Dreiecksmarkierung). Klicken Sie auf die Schaltfläche "Zeiger aktivieren" und wählen Sie dann die obere und untere Elektrode in der Reihe ganz links des Arrays aus, um die XY-Koordinaten für die Bildbegradigung und das Elektrodenmapping zu markieren.
- Wählen Sie im Dropdown-Menü "Slice-Typ" die Option "Horizontal" aus. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Standardstrukturen.
Anmerkung: Es ist möglich, die Strukturen anzupassen, indem Sie auf die Schaltfläche Neue Strukturen eingeben klicken. Die Standardstrukturen für den horizontalen Hirnschnitt sind in Abbildung 2A dargestellt.
- Wählen Sie mit den nummerierten Drucktasten unterhalb des Gehirnschnittbildes die Elektroden aus, die dem ROI entsprechen, und klicken Sie auf die entsprechende Drucktaste im Strukturfenster, um sie zuzuweisen (Abbildung 2B). Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden ROI.
- Drücken Sie die Schaltfläche Speichern: Die Software generiert einen Ergebnisordner mit dem Namen #EXP_LabelledElectrodes mit einer Tabelle mit den ausgewählten Elektroden und ROIs.
>3. Aufzeichnung und elektrische Modulation der epileptiformen Aktivität
- Lassen Sie die Gehirnscheibe vor der Aufnahme 5 - 10 Minuten lang in der Aufnahmekammer stabilisieren.
- Schalten Sie die Stimuluseinheit mindestens 10 Minuten vor dem Stimulationsprotokoll ein, um eine Selbstkalibrierung und Stabilisierung zu ermöglichen. Starten Sie die Stimulussteuerungssoftware und stellen Sie sicher, dass der Stimulator und der MEA-Verstärker korrekt angeschlossen sind, was durch eine grüne LED auf dem Hauptbedienfeld der Stimulussteuerungssoftware angezeigt wird.
- Richten Sie die Stimulation in einer bipolaren Konfiguration ein. Unter den Elektrodenpaaren, die mit der Schrift mapMEA kartiert sind, wählen Sie Elektrodenpaare aus, die mit der pyramidalen Zellschicht des CA1/proximalen Subiculums in Kontakt stehen (vgl. Abschnitt 24,25). Verbinden Sie mit einem Draht eine der ausgewählten Elektroden mit dem Minusstecker des Stimulators und die andere Elektrode mit dem Pluspol desselben Stimulatorkanals. Verwenden Sie einen anderen Draht, um die Masse des Stimulators mit der Masse des Verstärkers zu verbinden.
- Starten Sie die Aufnahmesoftware. Um Daten zu erfassen, drücken Sie die PLAY-Taste im Hauptfenster der Aufnahmesoftware. Mindestens 4 iktale Entladungen sind zu erfassen.
Anmerkung: Eine Abtastfrequenz von 2 kHz ermöglicht die Erfassung von Feldpotentialen mit fairer Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung des Speicherplatzverbrauchs. Eine 5-minütige Aufnahmedatei benötigt ~80 MB. Höhere Abtastfrequenzen können erforderlich sein, z. B. um Stimulusartefakte oder Multi-Unit-Aktivitäten aufzuzeichnen. Um nur Feldpotentiale zu beobachten, verwenden Sie einen Live-Tiefpassfilter bei 300 Hz, um die Aktivität mehrerer Einheiten zu unterbinden.
- Bestimmen Sie die Reizintensität.
- Verwenden Sie in der Stimulussteuerungssoftware das Hauptpanel, um eine quadratische biphasische Impulsdauer von 100 μs/Phase für einen positiv-negativen Strom zu entwerfen.
HINWEIS: VORSICHT! Die Gleichstromstimulation erfordert einen ausgeglichenen Ladungsimpuls, um eine Beschädigung des Geräts zu vermeiden.
- Führen Sie einen schnellen Eingabe-/Ausgabetest (I/O) durch, um die beste Stimulusintensität zu ermitteln. Der in Schritt 3.5.1 ausgelegte Stimulationsimpuls wird mit 0,2 Hz oder niedriger abgegeben, indem ein Interpulsintervall von 5 s oder länger in der entsprechenden Form der Stimulussteuerungssoftware hinzugefügt wird. Geben Sie auf der Registerkarte Pulsamplitude eine anfängliche Pulsamplitude von 100 μA/Phase ein und erhöhen Sie sie bei jedem Versuch um 50 - 100 μA-Schritte, bis die Stimulation zuverlässig interiktale Ereignisse in den parahippocampalen Kortexen hervorrufen kann (überprüfen Sie die von der Aufzeichnungssoftware visualisierten Signale).
- Elektrische Modulation der limbischen Iktogenese
- Programmieren Sie die Stimuluseinheit so, dass sie das gewünschte Stimulationsprotokoll liefert. Verwenden Sie die während des I/O-Tests identifizierte Stimulusamplitude.
Anmerkung: Die Fehlerquote evozierter Reaktionen sollte ≤20 % betragen.
- Überprüfen Sie nach Beendigung der Stimulation die Wiederherstellung des Netzwerks in den Zustand vor dem Stimulus, indem Sie mindestens 4 iktale Entladungen aufzeichnen (wie in Schritt 3.4).
