Navigationsverhalten von Drosophila-Larven als Reaktion auf optogenetische Stimulation olfaktorischer sensorischer Neuronen

Zusammenfassung

Quelle: Clark, D. A., et al. Verfolgung des Verhaltens von Drosophila-Larven als Reaktion auf optogenetische Stimulation von Geruchsneuronen. J. Vis. (2018).

Dieses Video zeigt eine Studie des Navigationsverhaltens von Drosophila-Larven als Reaktion auf optogenetische Stimulation von olfaktorischen sensorischen Neuronen (ORNs). Transgene Drosophila-Larven, die lichtempfindliche Ionenkanäle in den ORNs exprimieren, werden auf Agarose in einer Verhaltensarena platziert. Durch die optogenetische Stimulation mit Licht werden die Kanäle geöffnet, wodurch ein Kationeneinstrom entsteht, der die Übertragung des Signals an das Gehirn auslöst und das Navigationsverhalten aufgezeichnet wird.

Protokoll

>1. Aufbau einer Verhaltensarena und Vorbereitung der Hardware, um optogenetische Stimulation in der Verhaltensarena zu ermöglichen

1. Um eine lichtarme Verhaltensarena zu bauen, konstruieren Sie eine Box mit den Maßen 89 x 61 x 66 cm³ (35" L x 24" B x 26" H) aus schwarz gefärbten Plexiglas-Acrylplatten (3 mm dick) (siehe Materialtabelle). Materialien zum Bau einer solchen Box sollten in örtlichen Baumärkten erhältlich sein. Platzieren Sie diese Box auf einer Tischplatte im Verhaltensraum (Abbildung 1A).
2. Montieren Sie eine monochrome USB-3.0-CCD-Kamera (Universal Serial Bus) mit 830 nm (Infrarot) und einem 8-mm-F1,4-C-Mount-Objektiv (siehe Materialtabelle) in der Mitte der Decke der Blackbox. Platzieren Sie zwei Infrarot-Leuchtdioden (LED)-Streifen (siehe Materialtabelle) auf der Tischplatte, um die Larven in der dunklen Arena zu beleuchten (Abbildung 1A).
3. Um die LED-Plattform zu bauen, besorgen Sie sich eine 22 cm × 22 cm große quadratische Aluminiumplatte (vorzugsweise mit einem mattschwarzen Finish besprüht, um Reflexionen zu vermeiden). Schneiden Sie in der Mitte der Platte mit einem Metallschneider ein Loch, das groß genug ist, um um die CCD-Kamera zu passen.
4. Decken Sie die Metallplatte mit roten LED-Lichtbändern ab (siehe Materialtabelle). Löten Sie LED-Lichtbanddrähte in Reihe und führen Sie die Banddrähte in ein Optokopplerrelais ein, das von einem Raspberry Pi 2B-Mikroprozessor gesteuert wird (siehe Materialtabelle) (Abbildung 1B und 2).
5. Installieren und konfigurieren Sie das Betriebssystem Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux auf dem Raspberry Pi-Prozessor, bevor Sie das Optokoppler-Relais an die LED-Streifen anschließen. Schließen Sie ein Netzteil an, um die LED-Streifen und den Optokoppler mit Strom zu versorgen (Abbildung 2) (siehe Materialtabelle). Montieren Sie die LED-Plattform um die CCD-Kamera (Abbildung 1B).
   Anmerkung: Das Betriebssystem Ubuntu Mate v16.04 ist frei verfügbar. Eine Reihe einfacher Python-basierter Befehle kann leicht an die Programmierung von Mustern von LED-Lichtreizen angepasst werden (siehe Datei in der Syntax).
6. Sorgen Sie für eine homogene Bestrahlungsstärke an verschiedenen Stellen in der Verhaltensarena. Messen Sie die absolute Bestrahlungsstärke an der Oberfläche der Arena mit Hilfe eines Spektrometers und bestimmen Sie sie auf ~1,3 W/^{m 2} über die gesamte Oberfläche der Arena.
   Anmerkung: Bei dieser Intensität wurden im Verlauf der Experimente keine signifikanten Veränderungen der Temperatur beobachtet. Eine andere Studie verwendete eine höhere Bestrahlungsstärke von ~1,9 W/m² und beobachtete keine Temperaturänderungen im Verlauf der Experimente.

>2. Vorbereitung von Drosophila-Larven für Verhaltensanalysen

1. Halten Sie die Fliegen auf Standard-Fliegenfutter (siehe Materialtabelle) bei 25 °C, 50-60 % relativer Luftfeuchtigkeit (RH) und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 h/12 h.
2. Um CsChrimson in einem einzigen Paar von ORNs zu exprimieren, kreuzen Sie jungfräuliche Weibchen aus einer UAS-IVS-CsChrimson-Linie mit Männchen aus einer OrX-Gal4-Linie ("X" entspricht einem von 21 Larvenodorrezeptor (Or)-Genen, die in jedem von 21 ORN-Paaren eindeutig exprimiert werden).
   Um
   1. CsChrimson in allen 21 Larven-ORNs zu exprimieren, kreuzen Sie alternativ jungfräuliche Weibchen aus einer UAS-IVS-CsChrimson-Linie mit Männchen aus einer Orco-Gal4-Linie ("Orco" ist der Co-Rezeptor, der in allen 21 ORNs exprimiert wird).
   2. Verwenden Sie die UAS-IVS-CsChrimson-Linie allein als Kontrolle in diesen Experimenten.
      Anmerkung: Die hier aufgeführten Fliegenbestände sind alle im Bloomington Drosophila Stock Center erhältlich (siehe Materialtabelle).
3. Sobald sich männliche und weibliche Fliegen in einer Kreuzung 48 Stunden lang paaren und Eier legen dürfen, setzen Sie die erwachsenen Fliegen in ein frisches Fläschchen um.
   1. Auf die Oberfläche der Durchstechflasche mit Eiern werden 400 μl einer Mischung gegeben, die 400 μM all-trans Retinal (ATR) enthält, gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO), und 89 mM Saccharose, gelöst in destilliertem Wasser.
      Anmerkung: Die geringe Menge an Saccharose fördert die Fütterung der Larven mit der ATR-Lösung. ATR ist ein Cofaktor, der für die Hochregulierung der CsChrimson-Expression benötigt wird. ATR ist lichtempfindlich.
   2. Sobald ATR in die Lebensmittelfläschchen mit Eiern gegeben wurde, inkubieren Sie die Fläschchen im Dunkeln für weitere 72 h.
      HINWEIS: Obwohl in dieser Studie und in den beiden oben genannten Studien keine Auswirkungen auf das Verhalten der Larven aufgrund der ATR-Fütterung beobachtet wurden, wird empfohlen, die Auswirkungen der ATR-Fütterung zu kontrollieren, indem die Testlinien der gleichen Menge der oben genannten Mischung ausgesetzt werden, die kein ATR enthält.
4. Extrahieren Sie Larven des dritten Stadiums (~120 h nach der Eiablage) von der Oberfläche des Fliegenfutters, indem Sie sie mit einer Saccharoselösung mit hoher Dichte (15%) schwimmen lassen. Trennen Sie mit einer P1000-Mikropipette die auf der Oberfläche der Saccharoselösung schwimmenden Larven in ein 1000-ml-Glasbecherglas.
5. Waschen Sie die Larven 3–4 Mal, indem Sie jedes Mal 800 ml frisches destilliertes Wasser im Becherglas austauschen. Lassen Sie die Larven 10 Minuten ruhen, bevor Sie sie dem Verhaltenstest unterziehen.

>3. Verhaltens-Assay

1. Halten Sie eine konstante Temperatur (zwischen 22 und 25 °C) und Luftfeuchtigkeit (zwischen 50 und 60 % RH) im Verhaltensraum aufrecht.
2. Bereiten Sie das Larvenkriechmedium vor, indem Sie 150 ml geschmolzene Agarose (1,5 %) in eine 22 cm x 22 cm große quadratische Petrischale gießen. Für jeden Versuch des Assays wird eine Petrischale gegossen, 8-10 Versuche pro Experiment. Lassen Sie Agarose 1–2 h in den Petrischalen fest werden und abkühlen, bevor Sie sie im Verhaltenstest verwenden.​
   1. Übertragen Sie nicht mehr als 20 der vorbereiteten Larven des dritten Stadiums in die Mitte der Petrischale (Abbildung 1C). Decken Sie die Petrischale mit dem Deckel ab. Platzieren Sie die Petrischale in der Verhaltensarena unter der CCD-Kamera.
      Anmerkung: Je nach Experiment werden Verhaltensassays in der Regel für 3–5 Minuten durchgeführt. Wenn ein Odorierungsmittel im Assay verwendet wird, um Hinweise zu geben, wurde beobachtet, dass der resultierende Geruchsgradient für etwa 5 Minuten stabil bleibt. Längere Untersuchungszeiten werden nicht empfohlen. Schädliche Auswirkungen auf Larven aufgrund von Dehydration oder durch längere Exposition gegenüber 630 nm Rotlicht wurden innerhalb dieser Zeiträume nicht beobachtet.
3. Schalten Sie die 850 nm Infrarot-LED-Lichtquelle ein, um Larven im Video zu visualisieren. Starten Sie die CCD-Kamera, um die Bewegung der Larven aufzuzeichnen.
4. Programmieren Sie das Verfahren mit der Software, die mit dem Raspberry Pi-Prozessor verbunden ist, so, dass geeignete Muster der Rotlichtstimulation verwaltet werden.
   Anmerkung: Eine Reihe einfacher Python-basierter Befehle kann leicht an die Programmierung von Mustern von LED-Lichtreizen angepasst werden (siehe Datei in der Syntax).

Ergebnisse

Abbildung 1: Verhaltensarena und Krabbelmedium der Larve. (A) Frontansicht der Black-Box-Verhaltensarena. Die offene Tür der Arena gibt den Blick auf eine CCD-Kamera frei, die von der Decke der Loge hängt. (B) Die Unteransicht einer Metallplattform mit roten LED-Lichtstreifen, die für optogenetische Stimulationen verwendet werden, ist um die CCD-Kamera herum angebracht. (C...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Videokamera zur Erfassung der Larvenbewegung
CCD-Kamera	Edmund Optik	106215
M52 auf M55 Filtergewindeadapter	Edmund Optik	Tel.: 59-446
2" Filterhalter mit quadratischem Gewinde für Bildobjektive	Edmund Optik	Tel.: 59-445
RG-715, 2" Quadrat-Langpassfilter	Edmund Optik	Nr. 46-066
Elektronik für den optogenetischen Aufbau
Raspberry Pi 2B	RASPBERRY-PI.org	RPI2-MODB-V1.2
Programmierbares 3-Kanal-Netzteil	newegg.com	9SIA3C62037092
8-Kanal-Optokoppler-Relais	amazon.com	6454319
630 nm vierreihige LED-Streifen	environmentallights.com	rot3528-450-Rolle
850nm LED-Streifen	environmentallights.com	wp-4000K-CC5050-60x2-Bausatz
Software
Ubuntu MATE v16.04	Nubuntu	https://github.com/yslo/nubuntu
Andere Artikel
Plexiglas schwarzes Acryl	Home Depot	MC1184848bl
Fliegenfutter und andere Reagenzien
Nutrifly Fliegenfutter	Genesee Scientific	Nr. 66-112
Agarose-Pulver	Genesee Scientific	Nr. 20-102
22cm x 22cm quadratische Petrischale	VWR Inc.	Tel.: 25382-327
Dmso	Sigma-Aldrich	Nr. D2650
Saccharose	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 84097
Alle transretinalen	Sigma-Aldrich	R2500
Hosenschlitz
UAS-IVS-CsChrimson	Bloomington Drosophila Stock Center	Artikel-Nr.: 55134
Orco-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	Artikel-Nr.: 26818
OR42A-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	9970
Or7a-Gal4	Bloomington Drosophila Stock Center	Artikel-Nr.: 23907

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