MicroRNA-vermittelte Hemmung exzitatorischer postsynaptischer Ströme in Hippocampusschnitten der Maus

Zusammenfassung

Quelle: Thalhammer, A., et al. Kombinieren von Optogenetik mit künstlichen microRNAs, um die Auswirkungen des Gen-Knockdowns auf die präsynaptische Funktion in intakten neuronalen Schaltkreisen zu charakterisieren. J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt die microRNA-vermittelte Hemmung von exzitatorischen synaptischen Strömen in Hippocampus-Hirnschnitten von Mäusen. Die CA3-Neuronen wurden mit einem rekombinanten viralen Vektor infiziert, der ein Konstrukt zur Expression eines fluoreszierenden Reporters, einen lichtaktivierten Membrankanal und eine microRNA enthält, die die Expression von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen herunterreguliert. Nach dem Platzieren einer Scheibe in einer Aufnahmekammer und dem Patchen eines CA1-Neurons mit einer Aufnahmepipette wurden Lichtimpulse verwendet, um den lichtaktivierten Kanal zu stimulieren, was zu einem Ioneneinstrom führte und ein Aktionspotential erzeugte. Das Fehlen von spannungsgesteuerten Kalziumkanälen in CA3-Neuronen hemmt die Freisetzung von Neurotransmittern, was zu einer Hemmung exzitatorischer postsynaptischer Ströme in den synaptisch verbundenen CA1-Neuronen führt.

Protokoll

>1. Bewertung der Rolle präsynaptischer Proteine in intakten neuronalen Schaltkreisen durch gezielte Stimulation von heruntergeschalteten Neuronen mit Optogenetik

HINWEIS: Das folgende Protokoll erfordert vorherige Erfahrung mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen in akuten Hirnschnitten und Zugang zu einem elektrophysiologischen Aufbau.

1. Stereotaktische Injektion eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus mit Mosaik-Serotyp 1 und 2 (rAAV1/2) in das Gehirn. Bestimmen Sie die stereotaktischen Koordinaten für die interessierende Hirnregion mit stereotaktischen Atlanten für das Gehirn von Mäusen oder Ratten.
   Verwenden
   1. Sie einen Mikropipettenabzieher, um Injektionsmikropipetten mit langen Schäften von Ø 7–9 μm zu ziehen; klemmen Sie die Injektionsmikropipetten mit einer Schere auf die Schäfte. Verwenden Sie einen dünnen Marker und Millimeterpapier, um alle 2 mm Kalibriermarkierungen auf den Injektionsmikropipetten anzubringen.
   2. Betäuben Sie das Tier mit Isofluran und fixieren Sie es im stereotaktischen Apparat.
   3. Halten Sie das Tier während des gesamten Betriebs mit einem Heizkissen warm, das auf 37 °C eingestellt ist.
   4. Schützen Sie die Augen mit Augengleitmittel.
   5. Rasieren Sie das Fell auf dem Kopf mit einem Elektrorasierer.
   6. Verteilen Sie Povidon-Jod mit einem Wattestäbchen auf den rasierten Kopf.
   7. Machen Sie unter einem Präpariermikroskop einen Schnitt in der Mittellinie.
   8. Reinige die Schädeloberfläche mit einem Wattestäbchen, um das Bregma und Lambda sichtbar zu machen.
   9. Setzen Sie die Injektionsmikropipette in ihren Halter ein. Befestigen Sie die Halterung am stereotaktischen Arm.
   10. Bestimmen Sie die x- und y-Koordinaten der Injektionsstelle relativ zum Bregma und/oder zum Lambda.
   11. Verwenden Sie einen Bohrer, um den Schädel über dem Zielbereich auszudünnen.
       Anmerkung: Verwenden Sie sanfte kreisende Bewegungen und vermeiden Sie es, durch den Schädel zu bohren, da dies die Oberfläche des Gehirns beschädigt.
   12. Bei Blutungen überschüssiges Blut mit Handtuchpapier aufnehmen.
       Anmerkung: Übermäßiges Blut erschwert die korrekte Bestimmung der z-Koordinate.
   13. Laden Sie ≤2 μl Virus durch Kapillarwirkung in die Injektionsmikropipette.
   14. Bringen Sie die Injektionsmikropipette auf die x- und y-Koordinaten der Injektionsstelle.
   15. Berechnen Sie die z-Koordinate aus der Dura und senken Sie die Pipette langsam in das Gehirn ab.
   16. Wenn die z-Koordinate erreicht ist, warten Sie 3 Minuten, um die Gewebeanpassung zu ermöglichen.
   17. Üben Sie einen niedrigen Überdruck mit einer 1-ml-Spritze aus, die über einen flexiblen Schlauch an der Rückseite der Injektionsmikropipette angeschlossen ist. Überwachen Sie visuell die Geschwindigkeit des Auswurfs des Virus aus der Injektionsmikropipette durch das Dissektionsmikroskop und verwenden Sie die Kalibriermarkierungen als Referenzpunkte.
       Anmerkung: Das Virus muss langsam (<100 nL/min) injiziert werden, um Gewebeschäden zu vermeiden.
   18. Wenn die Injektion abgeschlossen ist, warten Sie 5 Minuten, ziehen Sie die Injektionsmikropipette um 0,2 mm zurück und warten Sie weitere 5 Minuten, um einen Rückfluss des Virus zu vermeiden.
   19. Ziehen Sie die Injektionsmikropipette langsam und vollständig aus dem Gehirn und entsorgen Sie sie in einem mit Bleichmittel gefüllten Behälter.
   20. Befeuchten Sie den Schädel mit physiologischer Lösung und nähen Sie die Haut mit 3-4 Stichen.
   21. Tragen Sie Gentamicin-Salbe auf die Wunde auf.
   22. Bringen Sie das Tier in einem sauberen Käfig mit Futterpellets und unter eine Wärmelampe, bis es sich vollständig erholt hat.
2. ≥15 Tage nach der Injektion die Tiere unter tiefer Isofluran-Anästhesie enthaupten.
3. Bereiten Sie akute Hirnschnitte der interessierenden Hirnregion mit einem Vibratom unter Verwendung von vergaster (95 % O₂, 5 % CO₂) eiskalter künstlicher Liquor cerebrospinalis (aCSF) vor, die (in mM) enthält: 123 NaCl, 1,25 KCl, 1,25 KH₂PO₄, 1,5 MgCl₂, 1 CaCl₂, 25 NaHCO₃, 2 Natriumpyruvat und 18 Glukose (Osmolarität angepasst auf 300 mOsm). Wenn es zum Beispiel darum geht, die synaptische Übertragung von CA3 zu CA1 pyramidalen Neuronen zu analysieren, bereiten Sie sagittale Schnitte der Hippocampus-Formation (350 μm dick) vor.
   Anmerkung: Arbeiten Sie ab diesem Schritt unter schlechten Lichtbedingungen, um eine Aktivierung der optogenetischen Sonde durch Umgebungslicht zu vermeiden.
4. Lassen Sie die Scheiben 30 Minuten lang bei 37 °C im selben aLiquor in einer Kammer für die Aufnahme von Hirnschnitten ziehen. Bewahren Sie die Scheiben bis zur Aufnahme in derselben Hirnschnittkammer bei Raumtemperatur auf.
   Anmerkung: Unter diesen Bedingungen können die Scheiben bis zu 6–8 Stunden lang gesund gehalten werden.
5. Übertragen Sie eine Scheibe in eine getauchte Aufnahmekammer und übermalen Sie sie mit 2 ml/min des gleichen aCSF, das für die Rückgewinnung verwendet wird, ergänzt mit 1,5 mM CaCl₂ (Gesamt-Ca²⁺: 2,5 mM) und ohne Natriumpyruvat.
   Anmerkung: Die Scheiben werden in einer niedrigen Konzentration von Ca²⁺ (1 mM) vorbereitet und gehalten, um die Toxizität zu minimieren. Die Aufzeichnungen werden in 2,5 mM Ca²⁺ durchgeführt, um die Vesikelfreisetzung zu begünstigen.
6. Überprüfen Sie kurz das Signal des exprimierten Fluoreszenzreporters (z. TdTomate; Abbildung 1B), um die Lokalisation und Intensität der Infektion zu ermitteln.
7. Füllen Sie eine Patch-Elektrode mit einer intrazellulären Lösung, die (in mM) enthält: 110 K-Gluconat, 22 KCl, 5 NaCl, 0,5 Ethylenglykol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N′,N′-TETRAESSIGSÄURE (EGTA), 3 MgCl₂, 4 Adenosin-5′-triphosphat-Magnesiumsalz (Mg-ATP), 0,5 Guanosin-5'-triphosphattrinatriumsalz (Na3-GTP), 20 K₂-Kreatinphosphat, 10-4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäurepuffer, angepasst an KOH (HEPES-KOH, pH 7,28, 290 mΩ).
   Anmerkung: Verwenden Sie eine Patch-Elektrode mit einem Pipettenwiderstand von 5–6 mΩ.
8. Unter Infrarotbeleuchtung erreichen Sie eine dicht verschlossene Ganzzellkonfiguration von einem Neuron, das synaptische Eingaben von den infizierten Neuronen erhält. Wenn beispielsweise CA3-Pyramidenneuronen infiziert wurden, flicken Sie die Pyramidenneuronen im proximalen bis medialen Trakt der CA1-Region (Abbildung 1C).
   Anmerkung: Der Serienwiderstand kann nicht kompensiert werden, sollte aber konstant und niedrig sein (≤20 MΩ).
9. Nutzen Sie die Pharmakologie, um die untersuchten synaptischen Ströme zu isolieren. Wenn es beispielsweise darum geht, die exzitatorische synaptische Übertragung zu untersuchen, blockieren Sie die inhibitorische synaptische Übertragung mit 10 μM Bicucullin.
10. Evozieren Sie synaptische Ströme, z. B. exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs), mit einem blauen 473-nm-Laser, der mit einer optischen Faser (Ø ≤250 μm) gekoppelt ist, die auf den Somata der infizierten Neuronen positioniert ist (z. CA3-Pyramidenneuronen).
    1. Passen Sie die Stimulationslänge auf ein Minimum an, um die Möglichkeit zu verringern, mehr als ein Aktionspotential pro Lichtimpuls hervorzurufen. Wenn Sie ChETA verwenden, stellen Sie es auf 2 ms ein.
    2. Passen Sie die Stimulationsstärke des Lasers an, um kleine, aber deutlich nachweisbare synaptische Ströme zu erzielen (≤50 pA Spitzenamplitude für EPSCs, die bei einem Haltepotential von -70 mV zwischen CA3- und CA1-Pyramidenneuronen aufgezeichnet wurden; Abbildung 1D). Bei Verwendung von ChETA und einer optischen Faser mit einem Durchmesser von 250 μm sollten Stimulationsstärken von 1–3 mW am Faserausgang geeignet sein.
       HINWEIS: Wenn die Laserstärke nicht reguliert werden kann, verwenden Sie Neutraldichtefilter.
    3. Richten Sie das 473-nm-Laserlicht auf die Spaltöffnungen der infizierten Neuronen, aber nicht auf ihre Axone. Richten Sie das Licht zum Beispiel auf CA3-Somata und weg von den Schaffer-Kollateralen, um eine direkte Depolarisation der Axone zu vermeiden.
    4. Tragen Sie Tetrodotoxin (TTX; 0,5 μM), einen Blocker von Natriumkanälen, auf die Probe auf, um zu bestätigen, dass die Kanäle vom Aktionspotenzial gesteuert werden.
    5. Wenden Sie in verschiedenen Aufzeichnungen einen selektiven Blocker auf den untersuchten synaptischen Strom an, um zu bestätigen, dass die Stimulation selektiv ist.
       Anmerkung: Wenden Sie z. B. 2,3-Dioxo-6-nitro-7-sulfamoyl-benzo[f]chinoxalin (NBQX, 10 μM) auf α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsäure (AMPA)-Typ Glutamatrezeptor-vermittelte EPSCs auf.
    6. Vergleichen Sie optisch und elektrisch evozierte synaptische Ströme im selben akuten Hirnschnitt als Reaktion auf wiederholte Stimulation (≥2 Stimuli bei ≤20 Hz). Ein ähnlicher Grad an synaptischer Erleichterung oder Depression sollte zwischen elektrischer und optischer Stimulation bei Verwendung einer Kontroll-microRNA (miR) beobachtet werden, was darauf hindeutet, dass ähnliche zelluläre Mechanismen durch die beiden Arten von Stimulationen aktiviert werden.
       Anmerkung: Die obigen Schritte sind notwendig, um sicherzustellen, dass die optische Stimulation keine direkte Depolarisation der präsynaptischen Boutons induziert und somit einige Mechanismen der synaptischen Übertragung umgeht.

Ergebnisse

Abbildung 1. Bewertung der Rolle von Ca_v2.1[EFa] und Ca_v2.1[EFb] im nativen Hippocampus durch gezielte Stimulation von heruntergeschalteten Neuronen mit Optogenetik. (A) Schema der Expressionskassette der rAAV-Konstrukte, die für die In-vivo-Infektion verwendet werden. (B) Hippocampus-Schnitt, der zeigt, dass die TdTomato-Fluoreszenz...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Hirnschnitte Vorkammer	Harvard-Apparatur	BSC-PC
CCD-Kamera-basierter Imager	Bio-Rad	ChemiDoc™ MP
Reagenzien für Zellkulturen	Lebenstechnologien
Bohrer	Foredom	K.1030
EGTA (EGTA)	Sigma	Nr. E4378
Gentamicin Salbe	Lokale Apotheke
Traubenzucker	Sigma	Nr. G7021
HEPES	Sigma	Artikel-Nr.: 54459
Mikropipetten für Injektionen	Narishige	GD1
Anorganische Salze und Reinigungsmittel	Sigma
K 2-Kreatinphosphat	Calbiochem	237911
KGluconate	Fluka	Artikel-Nr.: 60245
Laser	Laserglow-Technologien	LRS-0473-GFM-00100-03
Membran	Amersham	Protran™ 0,2 μm NC
MgATP	Sigma	Nr. A9187
Halter für Mikropipetten	Narishige	IM-H1
Abzieher für Mikropipetten	Narishige	PC-100
Na3GTP	Sigma	Nr. G8877
NaPyruvat	Sigma	Nr. P5280
Gleitmittel für die Augen	Lokale Apotheke	Lacrigel
Povidon-Jod	Lokale Apotheke	Betadin
Stereotaktische Apparatur	WPI
Tetrodotoxin	Tocris	Nr. 1069	giftig
Vibratom	Leica	VT1200S