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Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.
>1. Laden von Calciumfarbstoffen
- Wählen Sie Kalziumfarbstoffe basierend auf den Vorlieben des einzelnen Forschers aus. Hier verwenden wir Fluo-8AM oder Fluo-4AM. Diese Methode kann jedoch auch auf andere Farbstoffe angewendet werden: Calciumfarbstoffe in DMSO zu einer 1 mM Lösung und 1 % Blockcopolymeren (z. B. Pluronsäure-127) auf ein Endvolumen von 50 μl auflösen und 10 min lang beschallen.
- Die Lösung zu aCSF wird mit einer Endkonzentration von 10 μM und 0,01 % Blockcopolymeren für Hirnschnitte zugegeben.
- Bei erwachsenen Tieren (>12 Wochen) pipettieren Sie die Farbstoffe (50 μl) direkt auf die Gehirnschnitte und halten sie 75 Minuten lang, damit der Farbstoff besser in die tiefen Schichten eindringen kann.
- Um eine ausreichende Sauerstoffversorgung der eingetauchten Scheibe während der Farbstoffinkubation zu gewährleisten, bereiten Sie eine Glasladekammer mit geschlossenem Deckel (kreisförmiges Gefäß mit einem Durchmesser von 2,5 cm, 3,5 cm Höhe) mit Calciumfarbstoffen vor, die in 2,5 ml aCSF verdünnt sind. Kontinuierlich mit 95 % O2/5 % CO2 angereichert. Blasen Sie nicht.
- Nach der Beladung mit Farbstoff wird das Gewebe mit aCSF gewaschen und in das Inkubationssystem überführt, wobei die Temperatur langsam auf 15 - 16 °C reduziert wird, bis es für den experimentellen Einsatz bereit ist.
>2. Elektrophysiologische Aufzeichnungen und Bildgebung
- Legen Sie das Gewebe in eine getauchte Aufnahmekammer unter einem Mikroskop und perfundieren Sie es mit sauerstoffhaltigem aCSF bei einer Flussrate von 4 - 5 mL/min, entweder bei RT (~22 °C) oder physiologischer Temperatur (~35 °C). Halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle, indem Sie eine speziell angefertigte "Harfe" verwenden, die aus Nylon- oder Goldfäden besteht, die über ein U-förmiges Stück Gold- oder Platindraht gespannt und geklebt sind.
- Für die Elektrophysiologie:
- Bereiten Sie Aufzeichnungspipetten aus 1,5 mm (1,19 mm ID) Borosilikatglas mit einem Mikropipettenabzieher vor, um einen Endwiderstand von 5-6 MΩ zu erreichen.
- Füllen Sie die Pipette mit 3 - 4 μl interner Lösung und visualisieren Sie die Zellen unter infrarotem differentiellem Interferenzkontrast (IR-DIC) mit einer CCD-Kamera. Die intrazelluläre Lösung sollte sorgfältig auf jedes Experiment zugeschnitten werden, um experimentelle Ergebnisse zu erzielen.
- Positionieren Sie die Pipette unter Beibehaltung des Überdrucks, der durch eine Saugöffnung am Pipettenhalter auf der Membran einer Zelle ausgeübt wird, mit einem Mikromanipulator. Es ist kein vorheriges Abkratzen der Membran erforderlich, da das ILM von der Netzhaut entfernt wurde. Sobald sich die Pipette auf der Zelle befindet, üben Sie einen sanften Unterdruck auf die Pipette aus, um eine Gigaohm-Versiegelung zu erreichen. Brechen Sie dann die Zellmembran mit einem kurzen Unterdruck auf.
- Machen Sie Ganzzellen-Strom- oder Spannungszangenaufzeichnungen unter Verwendung von Standardtechniken.
- Calcium-Bildgebung:
- Für eine einzelne Anregungswellenlänge von Fluo-4 wird das Anregungslicht durch einen 460 - 490 nm Bandpassfilter und das emittierte Licht durch einen 515 - 550 nm Bandpassfilter gefiltert. Verwenden Sie eine Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera für die schnellste und empfindlichste Aufnahme. Erfassen Sie Bilder nach Bedarf.
- Messen Sie Änderungen der Fluoreszenz als Funktion der Zeit entweder bei einer einzelnen Wellenlänge (Fluo-4).