Testen monosynaptischer Verbindungen mit Tetrodotoxin und Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanälen

Zusammenfassung

Quelle: Zhang, X. et al., Untersuchung monosynaptischer Verbindungen in Drosophila unter Verwendung von Tetrodotoxin-resistenten Natriumkanälen. J. vis. exp. (2018)

Dieses Video zeigt das Testen monosynaptischer Verbindungen mit einer transgenen Fliege. Die Fliege hat Tetrodotoxin-resistente Natriumkanäle und Rotlicht-aktivierte Kanäle in ihren präsynaptischen Neuronen, die optogenetisch angeregt sind, Signale an postsynaptische Neuronen zu übertragen.

Protokoll

>1. Fliegen vorbereiten und GAL4-Promotorlinien identifizieren

1. Wählen Sie eine GAL4-Promotorlinie aus und kreuzen Sie diese mit Fliegen, die sowohl das UAS-NaChBac-Transgen als auch ein optogenetisches Transgen zur Aktivierung tragen.
   Anmerkung: UAS-CsChrimson wird aufgrund seiner hohen Leitfähigkeit und der Leichtigkeit, mit der es Tetrodotoxin (TTX)-resistente Natriumkanal (NaChBac)-vermittelte Aktionspotentiale aktiviert, ausgewählt. Sowohl UAS-NaChBac als auch UAS-CsChrimson sind im Bloomington Stocks Repository erhältlich.
2. Bereiten Sie all-trans Retinal als Stammlösung in Ethanol (35 mM) vor und lagern Sie die Lösung im Gefrierschrank bei -20 °C.
3. Mischen Sie 28 μl dieser Brühe in ca. 5 ml rehydriertes Kartoffelflockenfutter und geben Sie diese Mischung auf ein Fläschchen mit herkömmlichem Drosophila-Medium.
4. Aufziehen Sie erwachsene Fliegen, die csChrimson exprimieren, 1–3 Tage lang auf Nahrung, die 0,2 mM all-trans-Retinal enthält.

>2. TTX Vorrat vorbereiten

1. Stellen Sie eine Stammlösung von 1 mM TTX in destilliertem oder entionisiertem Wasser her. Bewahren Sie diese Lösung mehrere Monate lang in einem Laborkühlschrank auf. Informieren Sie sich über die Richtlinien der Institution bezüglich der Lagerung von TTX, da viele Institutionen TTX als gefährliche oder kontrollierte Substanz einstufen.

>3. Fliegen für die Elektrophysiologie vorbereiten

1. Sammeln Sie 1–3 Tage alte erwachsene Fliegen, die mit all-trans-retinal auf dem Futter aufgezogen werden.
2. Gib die Fliegen in ein Szintillationsfläschchen aus Glas. Stellen Sie das Fläschchen 1 Minute lang auf Eis, um die Fliegen ruhig zu stellen.
3. Verwenden Sie eine grobe Pinzette, um eine Fliege in eine speziell angefertigte Aufnahmekammer einzuführen. Die Kammer besteht aus einem 3 1/2" Kreis, der aus 1/16" Acryl lasergeschnitten wurde. Schneiden Sie ein 3/4" Loch in die Mitte, wo eine benutzerdefinierte Folie mit 2-Komponenten-Epoxidharz befestigt ist. Die Folie enthält eine dreieckige Hoffnung, in die die Fliege gesteckt wird.
4. Tragen Sie Wachs oder ultraviolett (UV) aushärtendes Epoxidharz um das Tier auf, um es fest in der Aufzeichnungskammer zu befestigen.
5. Beleuchten Sie die Präparation mit einer Schwanenhals-Lichtwellenleiter zur Visualisierung unter einem Stereomikroskop. Stellen Sie die Schwanenhalsfasern für eine schräge Beleuchtung ein, indem Sie sie so einstellen, dass sie die Fliege direkt von der Seite beleuchten.
6. Stellen Sie die Lichtstärke auf die niedrigstmögliche Einstellung ein, die immer noch eine klare Visualisierung der Fliege ermöglicht. Diese Lichtintensität variiert je nach Experiment.
   Anmerkung: Dieses Protokoll kann mit Hilfe einer In-situ-Hirnexplantationsmethode angepasst werden.
7. Externe Aufzeichnungssalzlösung abrufen. Die Kochsalzlösung enthält in mM: 103 Natriumchlorid, NaCl, 3 Kaliumchlorid, KCl, 5 N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethan-sulfonsäure, 8 Trehalose, 10 Glukose, 26 Natriumbicarbonat, NaHCO₃, 1 Natriumdihydrogenphosphat, NaH₂PO₄, 1,5 Calciumchlorid, CaCl₂ und 4 Magnesiumchlorid, MgCl₂ (angepasst auf 270–275 mΩ). Die Kochsalzlösung ist mit 95% O₂/5% CO_{2 (}Carbogen) gesprudelt und hat einen pH-Wert von 7,3.
8. Geben Sie 4-6 Tropfen extrazelluläre Aufzeichnungssalzlösung über das Fliegenpräparat. Erhöhen Sie an dieser Stelle das Lichtniveau am Präpariermikroskop, um eine bessere Sicht zu gewährleisten.
9. Schärfen Sie einen Wolframdraht durch Elektrolyse. Um den Draht herzustellen, bereiten Sie eine gesättigte Lösung von Kaliumnitrat, KNO₃, vor und legen Sie ca. 20 V Wechselstrom (AC) an, während Sie die Spitze des Drahtes 20 Mal für jeweils 100 ms in die Lösung tauchen, bis die Spitze geschärft ist. Verwenden Sie den geschärften Wolframdraht, um die Nagelhaut am Kopf der Fliege zu entfernen und so das Gehirn freizulegen.
10. Legen Sie das Gehirn weiter frei, indem Sie Luftröhren und Fettkörper, die es umgeben, entfernen. Wenn Sie auf die Antennenkeulen zugreifen, verwenden Sie einen gebogenen Wolframdraht oder ein ähnliches Werkzeug, um die Antennen vorsichtig unter die Folienaufzeichnungskammer zu stecken, um die Sichtbarkeit zu erhöhen. Reißen Sie mit einer scharfen Pinzette vorsichtig die Gliahülle ab, die den interessierenden Bereich bedeckt, in dem die Aufnahmen gemacht werden.
11. Übertragen Sie die Aufnahmekammer in das Elektrophysiologie-Rig. Beginnen Sie sofort mit der Perfusion mit externer Aufnahme von Kochsalzlösung, die mit Karbogen gesprudelt ist, um das Gehirn zu erhalten. Das Reservoir der Kochsalzlösung wird über dem Mikroskoptisch platziert und durch Schwerkraft dem Präparat zugeführt. Verwenden Sie eine Vakuumleitung und einen 2-Liter-Erlenmeyerkolben, um die Abfallsalzlösung aufzufangen.

4. Ganzzellaufzeichnung erhalten

1. Ziehen Sie Patch-Pipetten an einem handelsüblichen Pipettenabzieher. Konsultieren Sie das Handbuch für die Einstellungen, um eine geeignete Pipette mit einem Spitzenwiderstand nahe 7 mΩ zu erreichen.
2. Geben Sie 4 μl der internen Aufzeichnungslösung in eine Patch-Pipette. Die innere Kochsalzlösung besteht aus 140 Kaliumaspartat, 10 N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 4 Magnesiumadenosintriphosphat (MgATP), 0,5 Guanosin-5'-Triphosphattrinatriumsalzhydrat (Na3 GTP), 1 Ethylenglykoltetraessigsäure(EGTA) und 1 Kaliumchlorid (KCl) in mM.
3. Richten Sie den Patch-Clamp-Verstärker für die Ganzzellaufnahme ein. Stellen Sie den Offset des Verstärkers auf Null ein und stellen Sie den Verstärker so ein, dass er Testimpulse liefert. Hier kommt ein AM systems Patch Clamp Verstärker 2.400 zum Einsatz.
4. Üben Sie durch die Pipette einen positiven Druck aus und nähern Sie sich der Zelle. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Pipette zu lenken und die Zelle zu kontaktieren. Überdruck ablassen. Stellen Sie das Haltepotenzial der Membran auf -60 mV ein. Die Pipette sollte eine Gigaohm-Abdichtung mit der Zellmembran bilden, was sich in einem niedrigen Haltestrom im Sub-Pikoampere-Bereich zeigt.
   Anmerkung: Wenn Sie ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) gesteuertes Zell-Targeting verwenden, versuchen Sie, den Einsatz von Epifluoreszenzlicht zu minimieren, um eine ChR2-Aktivierung und eine mögliche synaptische Depression zu verhindern. Warten Sie auch einige Minuten, bevor Sie Schritt 5 anwenden.
5. Stellen Sie den Verstärker so ein, dass er Prüfimpulse von -50 mV bis -60 mV liefert. Diese Einstellung ist Standard bei Patch-Clamp-Verstärkern. Die Testimpulse zeigen einen großen kapazitiven Transienten, der den Strom darstellt, der zum Laden der Patch-Pipette erforderlich ist. Entfernen Sie kapazitive Transienten, indem Sie die Kapazitätskompensationsregler am AM 2400 oder einem ähnlichen Verstärker einstellen.
6. Wenden Sie kurze Impulse mit Unterdruck an, um die Zellmembran aufzubrechen und eine Ganzzellkonfiguration zu erhalten.
   Anmerkung: Eine Ganzzellkonfiguration wird beobachtet, wenn es einen starken Anstieg der kapazitativen Transienten gibt, der die Kapazität des Neurons anzeigt. Ein leichter Anstieg des Haltestroms (Baseline) wird wahrscheinlich ebenfalls zu beobachten sein. Stellen Sie den Verstärker auf den Stromzangenmodus ein und stellen Sie das Potential der Zelle auf -50 bis -60 mV ein.

>5. Testen der synaptischen Konnektivität

1. Konfigurieren Sie das Datenerfassungssystem so, dass ein LED-Treiber (Light Emitting Diode) ausgelöst wird, um Lichtimpulse zu erzeugen. Hier wird ein Datenerfassungssystem von National Instruments mit Matlab verwendet, um ein analoges Signal an einen LED-Treiber zu liefern. Die LED-Intensität wird über das analoge Signal an den Treiber eingestellt. Bei der LED handelt es sich um eine LED mit einer Wellenlänge von 620-630 nm.
2. Positionieren Sie die leistungsstarke rote LED direkt unter der Zubereitung. Stellen Sie die Lichtintensität so ein, dass 0,238 mW/mm² den Flyer erreicht.
3. Aktivieren Sie präsynaptische Neuronen während der Aufzeichnung von der postsynaptischen Zelle von Interesse. Erreichen Sie die Zellaktivierung optogenetisch, pharmakogentisch oder durch Nervenstimulation. Hier werden csChrimson und kurze Impulse von rotem Licht angewendet.
   HINWEIS: Synaptische Verbindungen können entweder in der Stromzange als exzitatorische postsynaptische Potentiale (EPSPs) oder in der Spannungszange als erregende postsynaptische Ströme (EPSCs) überwacht werden. Eine synaptische Verbindung sollte sichtbar sein, bevor TTX als Reaktion auf einen Lichtimpuls von 40 ms angewendet wird. Wenn keine Verbindung beobachtet wird, ist es unwahrscheinlich, dass die Neuronen entweder mono- oder polysynaptisch synaptisch verbunden sind. Das Haltepotential kann angepasst werden, um erregende oder inhibitorische Verbindungen entsprechend zu betonen.
4. Wenn eine Verbindung in normaler Kochsalzlösung beobachtet wird, fügen Sie TTX zum Perfusionssystem hinzu, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen. Verwenden Sie eine Umwälzpumpe, um die Kochsalzlösung aufzufangen und wiederzuverwenden, um TTX zu erhalten. Die Peristaltikpumpe zieht die Kochsalzlösung aus dem Bad und führt sie in das Salzreservoir zurück.
5. Stellen Sie die Drehzahl der Pumpe so ein, dass ein starkes, konstantes Vakuum entsteht, das ein Anheben und Senken des Salzspiegels im Bad verhindert.
   Anmerkung: Die Anwendung von TTX sollte zur Beendigung der Spike-Aktivität in dem Neuron führen, das in der gesamten Zelle überwacht wird. Dies bestätigt, dass der Kochsalzlösung genügend TTX zugesetzt wurde.
6. Wenden Sie erneut kurze Impulse von rotem Licht (40 ms für jeden Impuls) an. Zu diesem Zeitpunkt ist jede verbleibende synaptische Verbindung wahrscheinlich monosynaptisch.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fachhochschule-csChrimson	Bloomington Drosophila Stock Center	Artikel-Nr.: 55135	Wird als neuronaler Aktivator verwendet
UAS-NaChBac	Bloomington Drosophila Stock Center	9466	Resotores Erregbarkeit in Zellen in TTX
Tetrodotoxin	Tochris	Nr. 1078	Für den Kauf von TTX kann eine Sondergenehmigung erforderlich sein, da es sich um eine kontrollierte Substanz handelt
alle trans-retinal	Sigma-Aldrichall trans-retinal	R2500	Co-Faktor für Channelrhodopsin erforderlich
Schweißbares 321 Edelstahlblech, 0,002" dick, 10" breit	McMaster Carr	3254K7	Wird verwendet, um benutzerdefinierte Fliegenhalter herzustellen. Kundenspezifische Folien können bei pololu.com aus der bereitgestellten PDF-Datei lasergeschnitten werden
Präparier-Mikroskop	Zeiss	Stemi 2000-C	Wird zum Sezieren von Präparaten verwendet
Wachser	Almore	Eectra Waxer 66000	Wird während des Dissektionierens verwendet, um die Fly-In-Folie zu sichern
Paraffin	Joann	4917217	Verwendung mit Wachser
Pinzette Nummer 5	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	#5CO	Wird zum Sezieren und Enthüllen verwendet
Sezierschere	Werkzeuge für die Feinwissenschaft	Nr. 15001-08	Wird verwendet, um Teile der Nagelhaut während der Dissektion zu entfernen
Wolframdraht	A-M Systeme	Artikel-Nr.: 797500	Verwendung mit Elektrolyse zur Herstellung von geschärften Nadeln zum Sezieren
Umlaufende Peristaltikpumpe	Simply Pumps (Amazon)	PM200S	für Umlauf TTX
Drehzahlregler für Schlauchpumpe	Zitrades (Amazon)	N/A	PWM-Dimmregler für LED-Leuchten oder Bänder, 12 Volt 8 Ampere, einstellbarer Lichtschalter-Dimmer-Controller DC12V 8A 96W für LED-Streifenlicht B
Versa-Mount Präzisions-Druckluftregler	McMaster Carr	Nr. 1804T1	Zum Anlegen von Überdruck während des Patchens
Glas-Kapillaren	Welt Präzisionsinstrumente	TW150F-3	Für Patch-Pipetten
Mehrzweck-Messgerät	McMaster Carr	Artikel-Nr.: 3846K431	Manometer für Druckregler
Kamera für Elektrophysiologie	Dage MTI	IR-1000	Jede Kamera, die im IR-Bereich (850 nm) arbeitet, funktioniert. Sie möchten keine rote Beleuchtung verwenden, da dies csChrimson aktivieren kann
IR-LED	Thorlabs	M850F2	Für schräge Beleuchtung
Faseroptik für IR-LED	Thorlabs	M89L01	Kopplung an IR-LED
Objektiv	Olympus 40X	LUMPlanFLN	Dies kann auf den meisten Mikroskopen verwendet werden und eignet sich gut zur Visualisierung von Fliegenneuronen.
Gelbe LED	Thorlabs	M590L3d	Zur Visualisierung von RFP und mCherry
Blaue LED	Thorlabs	M470L3d	Zur Visualisierung von GFP
GFP Filter-Set	chroma	Artikel-Nr.: 49011	Zur Visualisierung von GFP oder zur Stimulation von channel2rhodopsin
Kundenspezifisches mCherry Filterset	chroma	ET580/25X und T600LPXR (aus dem Set 49306), jedoch mit einer ET610LP Barriere-/Emissionsoptik	Verwenden Sie diese Option nur, wenn Sie identifizierte Neuronen mit channel2rhodopsin patchen möchten
Dichroitisch zur Kombination von gelber und blauer LED	Thorlabs	DMLP550R	Verwenden Sie nur das Pflaster unter mCherry und regen Sie channel2rhodopsin mit blauem Licht an.
Rote LED	LEDSupply	Cree XPE 620 - 630 nm	Wird verwendet, um csChrimson zu fahren
LED-Treiber	LEDSupply	Artikel-Nr.: 3021-D-E-1000	Wird verwendet, um LEDs für die optogenetische Stimulation anzusteuern
Manipulator	Sutter Instrumente	MP-225	Wird verwendet, um die Pipette während der Aufnahme zu positionieren
Patchclamp Verstärker	A-M Systeme	Modell 2400	Ein gleichwertiger Verstärker ist geeignet
Bessel Filter	Warner Instruments	LPF 202A	Hilfsfilter zum Filtern der Stromspur zum Oszilloskop während des Patchings.
Datenerfassungssystem	Nationale Instrumente	NI PCIe-6321 781044-01	Wird verwendet, um Daten vom Verstärker auf den Computer aufzuzeichnen
Steckverbinderblock - BNC-Klemme BNC-2090A	Nationale Instrumente	Artikel-Nr.: 779556-01	Wird verwendet, um den Verstärker mit der Datenerfassungskarte zu verbinden.
Stahlfolie	McMaster Carr	3254K7	Stahlfolie für kundenspezifische Aufnahmekammer
Magnete	K&J Magnetics	Nr. D42	Zur Befestigung der Aufnahmekammer am Ringständer
1/16" Cell Cast Acryl Klar	Pololu		Wird verwendet, um eine benutzerdefinierte Aufnahmekammer herzustellen. Acryl kann bei pololu.com aus der bereitgestellten PDF-Datei lasergeschnitten werden