Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
1. Herstellung der Stimulationselektroden
- Um eine Stimulationselektrode herzustellen, schneiden Sie sechs 10 cm lange Stücke Miniatur-Verbindungsdrähte ab, entfernen Sie 2 cm der Verkleidung an einem Ende und 1 cm am anderen Ende.
- Verdrehen Sie zwei Kabel miteinander und löten Sie sie an der kürzeren geschälten Seite ein.
- Erwerben Sie einen Streifen mit einer Dreibandverpackung eines beliebigen integrierten Schaltkreises mit dem SOT-353-Gehäuse (Small Outline Transistor-353).
- Nähen Sie die verdrillten Drähte durch die drei Löcher der Verpackung. Das längere geschälte Segment der Drähte sollte sich in den Hohlräumen der Verpackung befinden. Positionieren Sie die Kabel so, dass das Ende der Isolierung mit dem Rand der Löcher übereinstimmt.
- Geben Sie den Zahnzement in die Löcher, um die Drähte zu befestigen.
Vorsicht: Der Zahnzement muss dicht genug sein, um ein Auslaufen in den Hohlraum der Verpackung zu vermeiden.
- Sobald der Zement erstarrt ist (mindestens 10 Minuten), drehen Sie die Packung um und geben Sie eine dünne Schicht Sekundenkleber in das Loch, um eine wasserdichte Abdichtung für den porösen Zement zu bilden. Vermeiden Sie es, die abgezogenen Drähte zu kleben.
- Verdrehen Sie die Kabel an der kürzeren geschälten Seite zusammen und löten Sie sie (Abbildung 1A).
- Fassen Sie das längere geschälte Segment der Drähte mit der Spitze einer feinen Pinzette, rollen Sie sie herum und wickeln Sie sie in die Hohlräume (Abbildung 1B). Schneiden Sie ggf. das überschüssige Kabel ab.
>2. Herstellung der Aufzeichnungselektroden
- Um eine Triplett-Elektrode herzustellen (Abbildung 1C-D), schneiden Sie mit einer Hochgeschwindigkeits-Rotationssäge ein ein einen Zentimeter langes Stück Edelstahlrohr ab. Entfernen Sie die Rippe mit einer scharfen Nadel von den Enden des Rohrs und stellen Sie sicher, dass das Rohr frei von Schmutz und vollständig durchlässig ist.
Anmerkung: Verwenden Sie keine Zange, da diese das Rohr verformt.
- Biegen Sie einen vergoldeten Distanzstift aus Pappe mit einer Mindestlänge von 3 cm zu einem J-förmigen Halter. Schneiden Sie den längeren Schenkel der "J"-Form ab und löten Sie ihn zusammen, um die ursprüngliche Form wiederherzustellen und eine lösbare Verbindung zwischen dem langen linearen Teil, der von der stereotaktischen Vorrichtung gehalten wird, und der "U"-Form, die die Elektrode hält und als Verankerungspunkt dient, herzustellen. Kleben Sie die Tube und das kürzere Bein des J-Halters zusammen. Kleben Sie bei Bedarf einige zusätzliche 1 cm lange Stäbe für die Stabilität auf.
- Schneiden Sie 3 Stück 2,5 cm lange Elektrodendrähte mit einer ultrafeinen Schere aus Edelstahl ab. Stellen Sie sicher, dass der Schnitt klar und scharf ist und dass die Isolierung an der kreisförmigen Oberfläche des Elektrodendrahts intakt ist. Achten Sie außerdem darauf, dass die Schnittspitze durch die ausgeübte Kraft nicht verbogen wird. Biegen Sie 1 oder 2 mm an einem Ende jedes der Drähte in verschiedenen Winkeln (z. B. ein gerader Links-, ein 45°- und ein rechter Winkel), um sie unterscheidbar zu machen.
- Füllen Sie das Rohr mit den Drähten. Wählen Sie einen geeigneten Abstand der Elektroden für das Experiment (z. B. beträgt der empfohlene Überstand der Spitzen der Drähte aus der Öffnung der Röhre für die Registrierung des kortikalen lokalen Feldpotentials (LFP) und der Stromquellendichte (CSD) 4,5 mm, 4,1 mm bzw. 3,7 mm). Notieren Sie, welcher Draht welcher Tiefe entspricht, um eine korrekte Kanalreihenfolge beizubehalten.
- Sobald die Drähte direkt nebeneinander ausgerichtet und parallel zum Rohr sind, geben Sie zum Fixieren der Elektrodendrähte einen einzelnen Tropfen flüssigen Sekundenkleber mit einer scharfen Nadel an beide Enden des Rohrs. Achten Sie darauf, dass der Kleber aufgrund der Kapillarwirkung in die Tube fließt, aber nicht in Richtung der Aufnahmestellen an den hervorstehenden Enden.
- Bereiten Sie eine Elektroden-Schnittstellenplatine mit einem geeigneten Mikrostecker vor, der mit dem zu verwendenden Aufnahmesystem kompatibel ist.
- Führen Sie die nicht aufzeichnenden, gebogenen Enden der Drähte in die Löcher der Elektroden-Schnittstellenplatine ein, die dem gewünschten Aufnahmekanal entsprechen. Wenn alle Drähte in Position sind, schiebe die goldenen Stecknadeln mit einer Pinzette in die Löcher.
Anmerkung: Goldstifte können zwar mit Zahnzement fixiert werden, sind aber in den meisten Fällen auch ohne diese Sicherheitsstufe stabil genug.
>3. Anästhesie
- Legen Sie das Tier in eine geschlossene Anästhesie-Induktionskammer und füllen Sie sie mit 4 - 5% Isofluran in 2 L/min medizinischer Luft.
- Wenn die Ratte liegt, nehmen Sie das Tier aus der Kammer und setzen Sie es in einen stereotaktischen Rahmen mit einem geeigneten Beatmungsnasenstück.
- Stellen Sie den Isofluranspiegel auf 2 % ein, obwohl die Luftstromrate gleich bleiben sollte. Überprüfen Sie den Grad der Anästhesie. Wenn der Rückzugsreflex der Pfote als Reaktion auf das Kneifen fehlt, fahren Sie fort, andernfalls erhöhen Sie die Narkosetiefe.
- Überwachen und halten Sie die Körpertemperatur der Ratte auf 37 ± 0,5 °C mit einem homöothermen Überwachungssystem. Tragen Sie einen Tropfen Paraffinsalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Wiederholen Sie diesen Vorgang bei Bedarf mehrmals während der Operation.
- 0,3 mg/kg Atropin subkutan injizieren, um die Schleimbildung in den Atemwegen zu vermeiden. Bei längeren Operationen wiederholen Sie dies alle vier Stunden. Überwachen Sie die Atmung und stellen Sie den Verdampfer bei Bedarf ein.
>4. Implantation der Stimulations- und Aufzeichnungselektroden
HINWEIS: Autoklavieren Sie alle notwendigen chirurgischen Instrumente und befolgen Sie während des gesamten Eingriffs sorgfältig die allgemeinen Regeln für Asepsis und Antisepsis. Vermeiden Sie es, nicht sterile Bereiche außerhalb des Operationsbereichs zu berühren. Tauchen Sie die Elektroden vor der Implantation 30 Minuten lang in Ethylalkohol (70%).
- Entfernen Sie die meisten Haare mit einem Haarschneider von der Kopfhaut. Tragen Sie die Enthaarungscreme auf die Kopfhaut auf, verteilen Sie sie gleichmäßig auf der Oberfläche und warten Sie einige Minuten. Verwenden Sie einen Spatel, um die Creme und die restlichen Haare vorsichtig zu entfernen. Spülen Sie die Haut mit Wasser und dann mit Desinfektionsmittel ab.
- Injizieren Sie 1 - 2% Lidocain (eine Gesamtdosis von 7 mg/kg nicht überschreiten) subkutan, um die Haut zu betäuben. Tragen Sie einen einzigen Tropfen Tiersalbe für die Augen (z. B. Paraffin) auf.
- Machen Sie mit einem Skalpell von der Stirn bis zum Hals einen gründlichen und langen (~2 cm) sagittalen Schnitt in der Mittellinie. Präparieren Sie das Gewebe, einschließlich des Periosts, vom Schädel. Reinigen Sie dann mit einem Meißel oder einer Zahnzange den Bereich zwischen den Crista der beiden Schläfenknochen. Ziehen Sie die präparierte Haut mit vier Bulldoggen zurück, um den Schädel freizulegen.
- Platzieren Sie eine feine Pinzette vorsichtig zwischen dem steilen Rand des Schläfenbeins und den Muskeln und trennen Sie diese. Machen Sie Jigging-Bewegungen, um so viel wie möglich von der großen Oberfläche des Schläfenbeins freizulegen, vorzugsweise vom Rand des Hinterhauptbeins bis zur Ebene der koronalen Nähte, ohne die Muskeln zu beschädigen.
- Platzieren Sie Retraktoren bitemporal, um die Schläfenknochen freizulegen.
- Spülen Sie die Schädeloberfläche mit 1 - 2 mL 3%igem Wasserstoffperoxid (H2O2) ab und waschen Sie sie anschließend mit 1 - 2 mL Wasser.
- Trocknen Sie die Oberfläche der Schläfenknochen sehr vorsichtig an der Luft und wischen Sie die Feuchtigkeit mit Augenstäbchen auf. Prüfen Sie, ob die Stimulationselektroden auf die gereinigte senkrechte Schädeloberfläche passen (die Oberkante der Stimulationselektrode sollte auf einer Linie mit der Kante der Crista des Schläfenbeins sein). Stellen Sie bei Bedarf die Bulldoggen und die Retraktoren neu ein oder formen Sie die Stimulationselektroden mit einer Schere.
- Füllen Sie die Hohlräume der Stimulationselektroden mit elektrisch leitfähigem Gel und tragen Sie eine dünne Schicht Kleber auf den Rand der Elektroden auf.
- Legen Sie die Stimulationselektrode mit einer präzisen Bewegung auf die trockene Oberfläche des Schläfenbeins und halten Sie sie eine Minute lang mit einer feinen Pinzette fest an Ort und Stelle. Achten Sie darauf, dass keine Feuchtigkeit mit dem Kleber in Berührung kommt. Wischen Sie bei Bedarf mit Okularstäbchen auf.
Vorsicht: Wenn die Elektrode instabil wird, entfernen Sie sie. Wiederholen Sie diesen Schritt nach der Reinigung des Knochens mit einer neuen Stimulationselektrode.
- Tragen Sie Zahnzement über die Ränder der Stimulationselektrode auf und trocknen Sie die austretende Feuchtigkeit im Gewebe kontinuierlich mit Okularstäbchen aus. Decken Sie dann die gesamte Stimulationselektrode mit Zement ab.
- Nachdem der Zement vollständig ausgehärtet ist, wiederholen Sie diese Schritte auf der kontralateralen Seite.
- Bohren Sie überall auf dem Schädel einige Löcher, um Schrauben zu verankern. Treiben Sie Minischrauben in die Löcher und tragen Sie Zahnzement darüber auf. Verwenden Sie einen Bohrkopf mit ~10 % kleinerem Durchmesser im Vergleich zum Schraubendurchmesser.
- Je nach Zweck der Experimente lötet man entweder einen Stecker an die Enden der Kabel, legt ihn auf die Oberfläche und bedeckt ihn mit Zement, oder man setzt die Implantation der Aufzeichnungselektroden und optischen Fasern fort oder präpariert ein Schädelfenster über dem Schädel. In letzterem Fall löten Sie die Verbinder und verankern Sie sie erst am Ende mit dem Konstrukt. Falls zeitgleiche TES- und LFP-Aufzeichnungen über einen längeren Zeitraum erforderlich sind, implantieren Sie die oben genannten Elektroden-Drillinge anstelle von Einzeldrähten.
Anmerkung: Dieser Aufbau ermöglicht die Entfernung von Gleichtaktstimulationsartefakten8. Einzelheiten zur Aufzeichnung der Elektrodenimplantation finden Sie in den vorherigen Protokollen.
- Waschen Sie die freiliegenden Taschentücher reichlich mit Desinfektionsmittel. Subkutan injizieren Sie 1 - 2% Lidocain (eine Gesamtdosis von 7 mg/kg darf nicht überschreiten).
- Entkleiden Sie die Wundränder und verschließen Sie sie mit einfachen unterbrochenen Nähten um den Konnektor/das Implantat. Desinfizieren Sie dann die Wunde mit Povidon-Jod.
- Injizieren Sie 5 mg/kg Carprofen subkutan. Wiederholen Sie dies bei Bedarf.
Anmerkung: Alle anderen Analgetika können verwendet werden, die den Anforderungen des örtlichen Ethikausschusses entsprechen.
- Unterbrechen Sie die Anästhesie, lösen Sie die Ohrstangen und den Nasenbügel und setzen Sie das Tier in einen postoperativen Aufwachkäfig, um das Bewusstsein wiederzuerlangen.
- Stellen Sie sicher, dass das Tier in den ersten postoperativen Stunden unter strenger Aufsicht steht. Überwachen Sie den Implantatbereich weiterhin regelmäßig.
Anmerkung: Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrecht zu erhalten. Halten Sie das Tier einzeln, bis es sich vollständig von der Prozedur erholt hat.
