>1. Herstellung von Aufzeichnungselektroden
- Ziehen der Glaselektroden
- Verwenden Sie das folgende Protokoll für den Mikroelektrodenabzieher (siehe Materialtabelle):
- Linie 1: Hitze 510 Zug - Geschwindigkeit 30 mal 250; Linie 2: Hitze 490 Zug - Geschwindigkeit 30 mal 250.
Anmerkung: Zeiteinheiten entsprechen 0,5 ms pro Einheit; Die anderen Einheiten sind relativ. Der Wert der Hitze sollte für jedes Filament angepasst werden, nachdem der Rampentest durchgeführt wurde.
- Stellen Sie mit einem Mikroskop (35-fache Vergrößerung) sicher, dass der Innendurchmesser der gezogenen Elektrode im Bereich von 7 - 10 μm liegt (Abbildung 1A). Lagern Sie die Kapillaren in dicht verschlossenen Behältern, um Staubansammlungen zu vermeiden.
- Feuerpolieren
- Kapillaren (80 - 90 % des maximalen Heizwertes für 1 - 2 s) mit einer Mikroschmiede feuerpolieren (siehe Werkstofftabelle). Stellen Sie sicher, dass der endgültige Innendurchmesser der polierten Elektrode 5 μm beträgt (Abbildung 1A).
- Biegen
HINWEIS: Es werden zwei Biegungen vorgenommen, um die Elektrode auf der Oberseite des Muskels unter einem Objektiv mit hoher Vergrößerung zu positionieren.
- Verwenden Sie das in Abbildung 1B gezeigte Gerät. Fixieren Sie die Elektrode im Manipulator und positionieren Sie die Spitze über dem Filament, ohne es zu berühren.
- Stellen Sie den Heizwert auf 60 - 70% des Maximums ein und betätigen Sie das Pedal der Mikroschmiede für 1 - 2 s (siehe Materialtabelle), um das Filament zu erhitzen. Ziehen Sie die Spitze der Elektrode mit einer L-förmigen Nadel vorsichtig nach unten (Abbildung 1B vergrößert). Machen Sie die Biegung bei ca. 90° (Abbildung 1C).
- Halten Sie die Elektrode mit einer Pinzette von Hand über die Flamme des Brenners und machen Sie die zweite Biegung in einem Abstand von 7 - 10 mm von der ersten Biegung und in einem Winkel von ca. 120o (Abbildung 1C).
>2. Zusätzliche vorbereitende Schritte
- Bereiten Sie hämolymphähnliche (HL3) Lösung (in mM) vor: 70 Natriumchlorid (NaCl), 5 Kaliumchlorid (KCl), 20 Magnesiumchlorid (MgCl2), 10 Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), 5 Trehalose, 115 Saccharose, 5 N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES) und 1 mM Calciumchlorid (CaCl2); stellen Sie den pH-Wert auf 7,3 - 7,4 ein. Bewahren Sie die Lösung im Kühlschrank auf und machen Sie sie jede Woche frisch.
- Stellen Sie Stimulationspipetten auf die gleiche Weise her wie die Aufnahme von Glaspipetten, nur dass sie nicht gebogen werden müssen.
Anmerkung: Die Herstellung von Stimulationselektroden wird in 28 und 27 ausführlich beschrieben. Der Enddurchmesser nach dem Feuerpolieren sollte im Bereich von 5 - 7 μm liegen.
- Führen Sie eine Stimulationspipette in einen Mikroelektrodenhalter ein, der mit einer Spritze verbunden ist.
>3. Elektrische Aufzeichnungen von erregenden Übergangsströmen (EJCs)
- Aufzeichnung
- Stellen Sie die Petrischale mit dem Präparat auf den Mikroskoptisch (Abbildung 2). Führen Sie die Referenzelektrode in das Bad ein.
- Füllen Sie die Aufzeichnungselektrode mit HL3-Lösung. Tauchen Sie die Elektrode unter dem 10-fach-Objektiv (siehe Materialtabelle) in das Bad und legen Sie sie mit dem Mikromanipulator (siehe Materialtabelle) über die Muskeln 6 und 7 der Bauchsegmente 2, 3 oder 4 (siehe Materialtabelle) (Abbildung 3 A.1 und A.2).
- Schalten Sie das Objektiv auf 60x um (siehe Materialtabelle). Konzentrieren Sie sich auf das interessierende Gebiet mit entweder Epifluoreszenz- oder DIC-Optik. Legen Sie die Spitze der Elektrode auf den synaptischen Bouton (Abbildung 3 B.1-3).
- Drücke die Elektrode ganz sanft auf den Muskel. Übermäßiger Druck kann die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) schädigen oder eine Zunahme der spontanen synaptischen Aktivität induzieren. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Elektrode nicht verstopft ist – wenn dies der Fall ist, ersetzen Sie sie.
- Schalten Sie den Verstärker, die A/D-Platine und den Computer ein.
- Wählen Sie den Spannungsklemmmodus am Verstärker.
- Starten Sie die Erfassungssoftware und wählen Sie den "lückenlosen" Modus.
- Beobachten Sie das Erscheinungsbild von Miniatur-exzitatorischen Verbindungsströmen (mEJCs) auf dem Computerbildschirm.
- Stellen Sie sicher, dass die Amplitude der mEJCs im Bereich von 0,2 - 0,7 nA.
Anmerkung: Kleinere EJCs weisen darauf hin, dass die Aufzeichnungselektrode Defekte aufweist oder nicht richtig positioniert ist.
- Anregung
- Platzieren Sie die Stimulationselektrode mit einem Mikromanipulator unter visueller Kontrolle in der Nähe des Axons, das die Bauchsegmente 2 - 4 innerviert.
- Üben Sie Unterdruck aus, indem Sie den Kolben der Spritze, die mit dem Elektrodenhalter verbunden ist, so ziehen, dass das Axon in die Elektrode gezogen wird (Abbildung 2).
- Schalten Sie den Stimulator ein. Drehen Sie den Knopf an der Isolationseinheit (siehe Materialtabelle), um einen Nullstrom einzustellen, und erhöhen Sie ihn dann vorsichtig, bis EJCs erscheinen (oder bis der Schwellenwert erreicht ist).
- Die Stimulation wird in einem Bereich über dem Schwellenwert durchgeführt, wobei der Stimulationsstrom im Vergleich zu der Schwelle für die Beobachtung von EJCs etwa doppelt so hoch ist.
Anmerkung: Unserer Erfahrung nach ist eine solche Stimulationsintensität optimal, um das Versagen von Aktionspotentialen und das Auslösen von Aktionspotentialen zu vermeiden. Wenn z. B. EJCs mit einem Stimulationsstrom von 0,2 mA auftreten, verwenden Sie während des gesamten Experiments einen Strom von 0,4 mA.
