Automatisierte bildgeführte Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung von Neuronen in Hirnschnitten

Zusammenfassung

Quelle: Wu, Q., et al. Anwendung einer automatisierten bildgesteuerten Patch-Klemme zur Untersuchung von Neuronen in Hirnschnitten. J. Vis. Exp. (2017).

In diesem Video werden Hirnschnitte in einer Aufnahmekammer immobilisiert und die interessierenden Zellen mit einem computergesteuerten Mikroskop lokalisiert und fokussiert. Das automatisierte Bildverarbeitungssystem positioniert dann präzise eine Patch-Pipette, um die Zellmembran zu versiegeln und elektrische Signale zu überwachen.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tierproben wurden von der zuständigen Ethikkommission für Tiere überprüft und genehmigt.

>1. Systemeinrichtung

1. Konstruieren Sie die Druckregeleinheit.
   1. Montieren Sie das Druckregelgerät gemäß dem Schaltplan (Abbildung 1). Löten Sie die erforderlichen Teile auf die Leiterplatte (PCB), die gemäß den Schaltplänen (Abbildung 1b) hergestellt wurde. Verwenden Sie Standardwiderstände, LEDs (Leuchtdioden), Metalloxid-Halbleiter-Feldeffekttransistoren (MOSFETs), Kondensatoren und Steckverbinder. Löten Sie Magnetventile auf die Leiterplatte (Printed Circuit Board). Verbinden Sie die Luftpumpe und den Luftdrucksensor mit einem elektrischen Kabel mit der Leiterplatte.
      HINWEIS: Nachdem alle notwendigen Teile verfügbar sind, sollte das Druckregelgerät in ca. 2 Stunden aufgebaut sein.
2. Schließen Sie die sekundäre Datenerfassungskarte an.
   1. Verbinden Sie die Datenausgänge von der Leiterplatte mit der Messkarte, gemäß Tabelle 1.
      Anmerkung: Die Datenerfassungskarte läuft im "Single-Ended-Modus". Die Portzuordnung finden Sie im Benutzerhandbuch (siehe Materialtabelle).
   2. Verbinden Sie "AIn Pr S" mit einem der analogen Eingangskanäle (AI) und "R-Gr" mit einer der analogen Massekarten auf der sekundären Datenerfassungskarte.
   3. Verbinden Sie den Primärausgang des Verstärkers mit einem der AI-Kanäle und die Masse mit der analogen Masse der sekundären Messkarte.
      HINWEIS: Ein Standard-BNC-Kabel kann verwendet werden, um den primären Ausgang des Verstärkers anzuschließen.
   4. Isolieren Sie das andere Ende ab und verbinden Sie das positive Signal (d. h. den Kupferkern) mit dem AI-Kanal und die Masse (d. h. den dünnen Draht um den Kern) mit der analogen Masse. Wiederholen Sie diesen Schritt für einen zweiten Kanal, wenn mehr als ein Patch-Kanal verwendet wird.
      HINWEIS: Der Analogeingang zur Datenerfassungskarte wird in späteren Schritten konfiguriert.
   5. Schließen Sie die Stromversorgung an den Stromausgang der sekundären Messkarte an. Verwenden Sie eine separate 12-V-Stromquelle für die Pumpe.
3. Schließen Sie den Schlauch an.
   1. Schließen Sie die Luftpumpe und die beiden Ventile an.
   2. Im letzten Schritt verbinden Sie mit einem 3-Wege-Verbinder den weichen Schlauch vom oberen Anschluss des Ventils 2 mit dem Drucksensor und dem Pipettenhalter.
   3. Wenn zwei Pipetten verwendet werden, fügen Sie einen weiteren 3-Wege-Anschluss an den Schlauch an, der mit dem Pipettenhalter verbunden ist. Wechseln Sie beim Patchen manuell zwischen den verwendeten Ventilen und den verwendeten Pipetten.
4. Autopatcher IG.
   installieren HINWEIS: Systemvoraussetzung: Autopatcher IG wurde nur auf einem PC mit Windows 7 getestet. Es wurde nicht für andere Betriebssysteme validiert. Die beschriebene Vorgehensweise gilt speziell für die Hardware, die in der Materialtabelle aufgeführt ist.
   1. Laden Sie Autopatcher-IG von GitHub herunter (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG).
   2. Installieren Sie Python (die Version und die Download-Adresse finden Sie in der Materialtabelle).
   3. Deinstallieren Sie die PyQt4-Bibliothek, indem Sie "pip uninstall PyQt4" in ein Befehlszeilenterminal eingeben.
      Anmerkung: Das System verwendet eine ältere Version der PyQt4-Bibliothek, um Kompatibilität mit den Qwt- und Opencv-Bibliotheken zu erreichen.
   4. Installieren Sie Python-Bibliotheken aus historischen Raddateien (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Suchen Sie die folgenden Dateien: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none-win32.whl) und Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl).
      1. Um die Raddateien zu installieren, gehen Sie in das Verzeichnis, in dem die Dateien gespeichert sind, und geben Sie "pip install ***wheelfilename***.whl" ein. Ersetzen Sie "***wheelfilename***" durch den tatsächlichen Namen der Datei.
         HINWEIS: "cp27" im Wheel-Dateinamen steht für Python 2.7 und "win32" für Windows 32-Bit. Wenn "win32" nicht funktioniert, versuchen Sie es mit "win64".
   5. Um die CCD-Kamera (Charge-Coupled Device) zu steuern, laden Sie das Installationsprogramm für die 64-Bit-Version (https://www.qimaging.com/support/software/) herunter und installieren Sie es. Laden Sie dann MicroManager für 64-Bit (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release) herunter, um die Kamera in Python zu steuern.
   6. Um die Manipulatoren und den Mikroskoptisch zu steuern, installieren Sie die vom Hersteller bereitgestellte Steuerungssoftware.
      Anmerkung: Auf diese Weise wird auch der Treiber installiert, der zur Steuerung der Manipulatoren erforderlich ist. Das Installationspaket wird in der Regel auf einer CD-ROM geliefert.
   7. Um die sekundäre Datenerfassungskarte zu steuern, installieren Sie die Universal Library von CD-ROM, die beim Kauf der Datenerfassungskarte enthalten ist.
5. Konfigurieren Sie die Hardware für Autopatcher IG.
   1. Schließen Sie den Mikroskoptisch und die Manipulator-Controller über USB-Anschlüsse an den Computer an.
   2. Weisen Sie die COM-Portnummern der Einheit 0: Mikroskoptisch, Einheit 1: linker Manipulator und Einheit 2: rechter Manipulator in dieser Reihenfolge in der Konfigurationsdatei "ports.csv" im Ordner "configuration" zu. Lassen Sie die anderen Parameter in der ports.csv Datei (z. B. "SCI" und "1") unverändert.
      Anmerkung: Die Informationen zur COM-Portnummer finden Sie, indem Sie die vom Hersteller bereitgestellte Konfigurationssoftware für den Manipulator ausführen. Gehen Sie auf die Registerkarte "Einstellungen", wählen Sie "Einstellungen" und die Seite "Bewegung" und lesen Sie die Beschriftungen für jede Registerkarte oben. Alternativ finden Sie diese Informationen im PC-Geräte-Manager.
   3. Weisen Sie auf der Messkarte analoge Eingangskanalnummern für einen Drucksensor zu und patchen Sie die Kanäle 1 und 2 (entsprechend Einheit 1 und 2). Geben Sie die Kanalnummer in der Datei "DAQchannels.csv" im Ordner "configuration" ein.
      Anmerkung: Es wird empfohlen, die .csv Dateien mit der Notepad-Anwendung anstelle einer Tabellenkalkulation zu öffnen, da sich die Informationen beim Speichern der Änderungen ändern können.
6. Führen Sie Autopatcher IG aus.
   1. Schalten Sie den Verstärker, den Mikroskop-Controller und den Manipulator-Controller ein. Stellen Sie sicher, dass die Verstärkersoftware ausgeführt wird.
   2. Führen Sie Autopatcher IG mit Python von einem Befehlszeilenterminal aus wie folgt aus: Ändern Sie zuerst das Verzeichnis (Befehl "cd" für die meisten gängigen Terminals), in dem Autopatcher IG installiert ist, geben Sie "python Autopatcher_IG.pyw" in das Befehlszeilenterminal ein und drücken Sie die Eingabetaste.
      HINWEIS: Führen Sie die Manipulatorsteuerungssoftware nicht aus, bevor Sie Autopatcher IG ausführen, da sie den Mikroskoptisch und den Manipulator belegt, was dazu führt, dass Autopatcher IG die Hardware nicht finden kann. Die Steuerungssoftware für den Manipulator kann nach der vollständigen Initiierung des Autopatchers IG ausgeführt werden, wenn zusätzliche Module zu steuern sind (z. B. die Inline-Heizung).
7. Kalibrieren Sie die Primärpipette.
   1. Ziehen Sie Patch-Pipetten. Füllen Sie eine gezogene Glaspipette mit einer internen Lösung und laden Sie sie auf den Kopftisch.
      HINWEIS: Leere Glaspipetten haben unter dem Mikroskop unterschiedliche Kontraste und können zu einer ungenauen Kalibrierung führen.
   2. Bewegen Sie die Pipettenspitze in das Gesichtsfeld des Mikroskops und stellen Sie es in den Fokus. Wenn die Wähltastatur zum Bewegen der Manipulatoren und/oder des Mikroskoptisches verwendet wird, aktualisieren Sie die Koordinaten, indem Sie "z" auf der Tastatur drücken.
      Anmerkung: Diese Aktion ist nicht erforderlich, wenn die Tastatur (Mikroskoptisch: A/D - x-Achse, W/S - y-Achse, R/F - z-Achse; Manipulatoren: H/K - X-Achse, U/J - y-Achse, O/L - z-Achse, 1/2 - Einheitennummer) zur Steuerung der Bewegung verwendet wird, da die Koordinaten in Echtzeit aktualisiert werden.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Kalibrierung starten" in der grafischen Benutzeroberfläche (GUI) für die entsprechende Einheit, auf der die Pipette geladen ist (Abbildung 2).
      Anmerkung: Wenn die Kalibrierung abgeschlossen ist, erscheint ein Pop-up-Fenster.
      HINWEIS: Die Kalibrierung wird automatisch durchgeführt, was ca. 3,5 Minuten dauert. Ein Klick auf die gleiche Schaltfläche (nach dem Starten der Kalibrierung auf "Kalibrierung abbrechen" umgeschaltet) bricht den Kalibrierungsversuch ab.
   4. Speichern Sie die Kalibrierung, indem Sie unten in der Haupt-GUI auf "Kalibrierung speichern" klicken (sie speichert die aktuelle Kalibrierung für beide Manipulatoren und kann in Zukunft geladen werden).
      HINWEIS: Das Sichtfeld bei niedriger (4- oder 10-facher) und hoher (40-facher) Vergrößerung muss ausgerichtet werden, damit die sekundäre Kalibrierung ordnungsgemäß funktioniert. Bitte beachten Sie für die Ausrichtungsvorgänge das Benutzerhandbuch des verwendeten optischen Systems.
       

>2. Automatisches Patch-Clamp-Verfahren

1. Akute Hirnschnitte vorbereiten
2. Bereiten Sie Glaspipetten für die Patch-Klemme vor.
3. Platzieren Sie eine Gehirnscheibe in der Mitte der Aufnahmekammer. Stabilisieren Sie die Scheibe mit einem Scheibenhalter oder einer "Harfe".
4. Erkennen Sie die Fluoreszenzzelle.
   1. Suchen Sie den Interessenbereich unter dem 4X-Objektiv. Verschieben Sie den Mikroskoptisch, indem Sie den Click-to-Move-Modus ("CTM") aktivieren und auf die Mitte des gewünschten Bereichs klicken. Alternativ können Sie den Mikroskoptisch über die Tastatur bewegen (A/D - x-Achse, W/S - y-Achse, R/F - z-Achse).
   2. Wechseln Sie zum Objektiv mit hoher Vergrößerung und stellen Sie den Fokus ein, indem Sie das Mikroskop in der z-Achse mit R/F auf der Tastatur bewegen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Wasserbadstufe so einzustellen, dass die Brennebene unter den Linsen mit niedriger und hoher Vergrößerung in der z-Achse gleich oder ähnlich ist.
   3. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Detect Cell" in der Hauptspalte der GUI, "Unit 0". Wenn die LED- oder Laserlichtquelle des Setups nicht durch das TTL-Signal gesteuert werden kann, schalten Sie die LED/den Laser manuell ein. Ein Popup-Fenster wird angezeigt, wenn die Zellenerkennung abgeschlossen ist.
      1. Schalten Sie die LED/den Laser aus, falls erforderlich; eine Liste der Zellenkoordinaten wird in der GUI "Speicherpositionen" angezeigt. Entfernen Sie unerwünschte Zellen aus der Liste, indem Sie auf die Schaltfläche "X" neben den Koordinaten klicken.
      2. Wenn die Zielzellen nicht fluoreszierend markiert sind, klicken Sie alternativ auf "Mausmodus" in der Hauptbenutzeroberfläche. Klicken Sie auf die gewünschte Zelle. Auf der Zelle erscheint ein gelber Punkt mit einer Zahl, und die Koordinaten der Zelle werden in der GUI "Speicherpositionen" angezeigt.
5. Kalibrieren Sie die Sekundärpipette.
   1. Füllen Sie 1/3 einer Glaspipette mit interner Lösung. Legen Sie die Pipette in den Pipettenhalter, der am Kopftisch befestigt ist.
   2. Verwenden Sie das Objektiv mit geringer Vergrößerung. Bringen Sie die Pipette in das Gesichtsfeld und stellen Sie den Fokus über die Tastatur ein (H/K - x-Achse, U/J - y-Achse, O/L - z-Achse). Verwenden Sie "1" und "2", um zwischen Einheit 1 und Einheit 2 zu wechseln.
   3. Laden Sie die primäre Kalibrierung, indem Sie auf "Kalibrierung laden" klicken. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Sekundäre Kalibrierung" in der Hauptbenutzeroberfläche unter dem Gerät, das gerade verwendet wird. Wenn beispielsweise Einheit 2 verwendet wird, klicken Sie auf die Schaltfläche "Sekundärkalibrierung" in der Spalte "Einheit 2". Befolgen Sie die Anweisungen im Popup-Fenster, um zum Objektiv mit hoher Vergrößerung zu wechseln.
6. Patchen Sie eine Zielzelle.
   1. Stellen Sie sicher, dass die Software "MultiClamp" (d.h. Verstärker) läuft. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Patch-Kontrolle", um die GUI "Patch-Kontrolle" zu öffnen. Es kann bis zu einigen Minuten dauern, bis diese GUI geöffnet ist.
   2. Verwenden Sie das Objektiv mit 40-facher Vergrößerung, indem Sie in der Hauptspalte "Einheit 0" der GUI "40X" aktivieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Gehe zu" neben der gewünschten Zelle in der Koordinatenliste in der GUI "Speicherposition". Das Mikroskop bewegt sich zur Zelle.
   3. Klicken Sie auf die CTM-Schaltfläche des Geräts, das in der Hauptbenutzeroberfläche verwendet wird, um die Bewegung nach einem Mausklick zu aktivieren. Klicken Sie auf die gewünschte Zelle. Die Pipettenspitze bewegt sich zur Zelle.
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Patch" in der GUI "Patch control".
      Anmerkung: Das automatische Patchen beginnt, und der Druck und der Widerstand können auf der GUI "Patch control" überwacht werden.
      1. Verwenden Sie die Taste "Einheit 1 ausgewählt", um das Eingangssignal zwischen den beiden Einheiten umzuschalten.
         HINWEIS: Das System nähert sich der Zielzelle, übt Unterdruck aus, passt das Zellmembranpotenzial an und erkennt die Bildung von Gigasiegeln auf der Grundlage einer Reihe von Druck- und Widerstandsschwellen und Logik.
      2. Sie können den automatischen Prozess jederzeit manipulieren, indem Sie auf die entsprechenden Schaltflächen in der "Patch Control"-GUI klicken. Klicken Sie beispielsweise erneut auf die Schaltfläche "Patch", um die Patch-Testversion abzubrechen, und klicken Sie auf "Nächste Stufe", um den Patching-Prozess unabhängig von der Schwelle zum nächsten Schritt zu führen.
         HINWEIS: Ein Popup-Fenster benachrichtigt den Benutzer, wenn sich ein Gigaseal gebildet hat, und die Option zum Anwenden von Zap zusammen mit großem Unterdruck wird angezeigt.
   5. Wählen Sie "Ja", um mit kombiniertem Zap und Saugen einzubrechen. Alternativ können Sie auch "Nein" wählen, um nur mit Saugkraft einzufahren.
      HINWEIS: Wenn ein erfolgreicher Patch für ganze Zellen abgeschlossen ist, wird der Benutzer in einem Popup-Fenster daran erinnert, das Experiment-Patch-Protokoll zu speichern.
   6. Speichern Sie das Patch-Protokoll des Experiments.
      HINWEIS: Wenn eine Patching-Testversion nicht erfolgreich ist, wird der Benutzer in einem Popup-Fenster benachrichtigt und der Patch-Vorgang wird zurückgesetzt.
   7. Gehen Sie zurück zu Schritt 2.4 und wiederholen Sie die Schritte mit einer anderen Zelle.

Ergebnisse

Tabelle 1. Konfiguration der Verbindungskonfiguration für die Leiterplatte (PCB) zur sekundären Datenerfassungsplatine. Verwenden Sie diese Tabelle, um Leiterplattenausgänge (erste Spalte von links) mit Anschlüssen auf der Messkarte (zweite Spalte von links) zu verbinden. Der Portname und die Portnummer auf dem sekundären Datenerfassungssystem beziehen sich auf den Single-Ended-Modus.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CCD-Kamera	QImaging	Rolera Schraube
Elektrophysiologie-Rig	Wissenschaftliche Daten	SliceScope Pro 2000	Enthalten Sie ein Mikroskop und Manipulatoren. Die vom Hersteller bereitgestellte Manipulatorsteuerungssoftware, die in diesem Manuskript demonstriert wird, ist "Linlab2".
Verstärker	Molekulare Bauelemente	MultiClamp 700B	computergesteuerter Mikroelektrodenverstärker
Digitalisierer	Molekulare Bauelemente	Axon Digidata 1550
LED-Lichtquelle	Coole LED	pE-100	488nm Wellenlänge
Datenerfassungs-Board	Messtechnik	USB1208-FS	Sekundäre Datenerfassung. Siehe Handbuch unter : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf
Magnetventile	Die Lee Co.	LHDA0531115H
Luftpumpe	Virtuelle Industrie	VMP1625MX-12-90-CH
Luftdrucksensor	Freescale Halbleiter	MPXV7025G
Scheiben-Haltetaste	Warner-Instrumente	64-1415 (SHD-40/2)	Scheibenanker-Set, flach für RC-40 Kammer, 2,0 mm, 19,7 mm
Python	Anakonda	Version 2.7 (32-Bit für Windows)	https://www.continuum.io/downloads
Schraubklemmen (2-polig)	Funkenspaß	PRT - 08084	Schraubklemmen Raster 3,5 mm (2-polig)
N-Kanal MOSFET 60V 30A	Funkenspaß	COM - 10213
DIP-Steckdosen Lötschwanz - 8-polig	Funkenspaß	PRT-07937
LED - Basic Rot 5mm	Funkenspaß	COM-09590
LED - Basic Grün 5mm	Funkenspaß	COM-09592
DC-Hohlstecker-Buchse/Steckverbinder (SMD)	Funkenspaß	PRT-12748
Netzteil - 12VDC 600mA	Funkenspaß	TOL-09442
Anschlussdraht - Sortiment (Vollkern, 22 AWG)	Funkenspaß	PRT-11367
Verriegelung Stecker x Buchse x Weiblicher Absperrhahn	ARCHE-PLAS	RCX10-GP0
Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Schläuche	Fischer wissenschaftlich	Tel.: 14-171-129	Außendurchmesser: 1/8 Zoll Innendurchmesser: 1/16 Zoll.
BNC-Stecker auf BNC-Stecker Koaxialkabel	Belkin Komponenten	F3K101-06-E
560 Ohm Widerstand (5% Toleranz)	Radioshack	2711116
Picospritzer	Allgemeines Ventil	Picospritzer II